納洛酮對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)凋亡的影響*

孫林林 徐澤紅 楊偉科 邵彩霞 李志營 陳 揚(yáng)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage, SAH)是比較常見的顱內(nèi)血管病變所致疾病，嚴(yán)重威脅人類健康，老年人多發(fā)，發(fā)病突然且救治困難，是出血性腦卒中猝死的最常見原因。隨著腦血管顯微外科及新技術(shù)的發(fā)展，SAH早期腦損傷被認(rèn)為與預(yù)后相關(guān)[1]，早期腦損傷若能得到及時(shí)干預(yù)則可明顯改善預(yù)后[2]。文獻(xiàn)[3]報(bào)道SAH早期腦損傷是通過多種途徑共同作用的結(jié)果，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是SAH后早期腦損傷的重要原因之一，針對(duì)細(xì)胞凋亡的早期干預(yù)可能是治療早期腦損傷的重要有效措施之一[4]。納洛酮(Naloxone)是特異性類阿片拮抗劑，通過競(jìng)爭(zhēng)阿片受體(μ，κ，δ)而起作用，是臨床比較常見的藥物，其應(yīng)用取得不錯(cuò)的療效。有研究報(bào)道納洛酮可影響神經(jīng)細(xì)胞損傷的病理生理改變[5]。本研究通過經(jīng)頸外動(dòng)脈頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法制作SAH模型，探討納洛酮對(duì)SAH大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)凋亡的影響，為SAH早期腦損傷的臨床救治提供基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑和藥物

納洛酮：四川青木制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20153168(1ml；0.4mg)。穿梭箱設(shè)備及視頻分析系統(tǒng)：上海軟隆科技發(fā)展有限公司。手術(shù)顯微鏡及掃描系統(tǒng)、組織包埋機(jī)：德國萊卡公司。蘇木素、伊紅：碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠24只，購于鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，許可證號(hào)SCXK-(豫)2019-0002，月齡4.5±2月，體質(zhì)量350±15g，正常光照通風(fēng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，實(shí)驗(yàn)前12h禁食禁水。本實(shí)驗(yàn)符合倫理學(xué)要求。

1.3 動(dòng)物模型制作流程及分組

參考文獻(xiàn)[6]采用經(jīng)頸外動(dòng)脈頸內(nèi)動(dòng)脈刺破法制備大鼠SAH早期腦損傷模型。采用水合氯醛腹腔注射(10%，3.2ml/kg) 麻醉大鼠，麻繩束帶固定四肢及頭部，頸部術(shù)區(qū)無菌處理，頸部切口，暴露頸總、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，離斷頸外動(dòng)脈，一端銳化的纖芯從頸外動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，進(jìn)入2.0cm刺破血管(刺破位置位于大腦中動(dòng)脈大腦前動(dòng)脈分叉處)，停留10s左右，拔出線栓，逐層縫合。保溫復(fù)蘇后繼續(xù)飼養(yǎng)。造模成功判斷標(biāo)準(zhǔn)：纖芯深度；血管刺破感；取材時(shí)蛛網(wǎng)膜下腔血塊。大鼠依次編碼，隨機(jī)數(shù)字表法分三組(每組各8只)，Sham組：操作相同，不刺破血管；早期腦損傷(Early Brain Injury，EBI)組：按上述造模方法處理大鼠；Naloxone組：SAH早期腦損傷+納洛酮處理，給藥方法[5]：造模成功后給予腹腔注射Naloxone(1.0mg/kg)，1次/12h，用藥至72h處死時(shí)間點(diǎn)；Sham組和EBI組同法注射等量生理鹽水。

1.4 穿梭箱實(shí)驗(yàn)

造模前2天實(shí)驗(yàn)大鼠每天進(jìn)行2次訓(xùn)練，培養(yǎng)條件反射。造模后72h首先適應(yīng)環(huán)境5min去除條件反射，隨后給予5s聲光刺激，再給予30s 30V電刺激，記錄大鼠行為足跡，間隔20s實(shí)驗(yàn)一次，循環(huán)30次，分析逃避反應(yīng)次數(shù)(大鼠每次實(shí)驗(yàn)受30s電刺激內(nèi)逃離危險(xiǎn)區(qū)的次數(shù))及逃避反應(yīng)時(shí)間(大鼠每次實(shí)驗(yàn)受30s電刺激內(nèi)逃離危險(xiǎn)區(qū)的的平均時(shí)間)。

1.5 海馬組織HE染色

實(shí)驗(yàn)大鼠穿梭箱之后麻醉處死，4%的多聚甲醛250ml灌注取腦，并浸泡固定2天，厚度5.0mm切取帶有海馬的腦組織，包埋筐中石蠟包埋，5μm厚度冠狀面切片。每個(gè)組織塊選取6張帶有海馬區(qū)的切片進(jìn)行HE染色。光鏡(×400)觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，隨機(jī)選取6個(gè)視野采集圖片，Motic-6.0軟件分析有無異常神經(jīng)細(xì)胞并計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.6 TUNEL染色

選取帶有海馬區(qū)的石蠟切片進(jìn)行TUNEL染色，二甲苯、梯度酒精脫蠟、固定、孵育、二氨基聯(lián)苯胺顯色，樹膠封片等，按TUNEL染色試劑盒染色，對(duì)帶有海馬的腦組織進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)。光鏡(×400)觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，Image J軟件進(jìn)行圖像分析，TUNEL染色是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。萎縮及固縮的神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)TUNEL染色后，細(xì)胞質(zhì)呈淺棕色或棕褐色，結(jié)構(gòu)破壞，空泡受損。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)檢測(cè)

各組逃避反應(yīng)次數(shù)和逃避反應(yīng)時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Sham組比較，EBI組逃避反應(yīng)次數(shù)減少(t=5.28,P<0.05)，逃避反應(yīng)時(shí)間延長(t=4.17,P<0.05)。與EBI組比較，Naloxone組逃避反應(yīng)次數(shù)增多(t=3.23,P<0.05)，逃避反應(yīng)時(shí)間縮短(t=4.35,P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠穿梭箱結(jié)果比較

2.2 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞HE染色比較

Sham組海馬區(qū)正常形態(tài)神經(jīng)細(xì)胞居多，細(xì)胞質(zhì)均一，細(xì)胞核染色適中，排列整齊，胞核清晰。EBI組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核出現(xiàn)紫色深染，排列紊亂，可見梭形固縮及核破裂。Naloxone組正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較EBI組明顯增多，梭形固縮及核破裂均減少。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)HE染色結(jié)果(×400)

表2 各組大鼠海馬區(qū)HE染色

2.3 各組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞TUNEL染色比較

Sham組可見少量淺棕色深染細(xì)胞；EBI組可見淺棕色細(xì)胞增多；Naloxone組淺棕色細(xì)胞相對(duì)減少，比Sham組稍增多。見圖2、表3。

表3 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞TUNEL染色

圖2 各組大鼠海馬區(qū)TUNEL染色結(jié)果(×400)

3 討 論

細(xì)胞凋亡在心肌及肝細(xì)胞中研究多年，但關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)研究相對(duì)較少，相關(guān)動(dòng)物研究表明[7，8]早期腦損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡72h達(dá)到高峰，且明顯影響神經(jīng)功能，故本研究選擇72h進(jìn)行觀察，采取對(duì)細(xì)胞凋亡敏感的TUNEL 染色，觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。相關(guān)文獻(xiàn)[9,10]報(bào)道，SAH后大鼠的行為能力變差，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)改變明顯，存活比率下降。其作用機(jī)制可能是SAH后蛛網(wǎng)膜下腔的阿片肽發(fā)生改變，進(jìn)而引起腦損傷[11]。學(xué)者們也在顱腦損傷動(dòng)物模型腦組織內(nèi)檢測(cè)到內(nèi)源性阿片肽的升高，其升高會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的進(jìn)一步加重[12]。納洛酮為羥(二)氫嗎啡酮衍生物，為臨床常用藥物，最早在臨床上應(yīng)用是臨床麻醉拮抗藥，對(duì)抗阿片類藥物過量所致的呼吸功能減弱[13]，其具有很好的親脂性，能使其很好的通過血腦屏障。納洛酮的作用機(jī)制主要通過阻斷β內(nèi)啡肽來改善神經(jīng)細(xì)胞的血供，改善缺氧缺血所導(dǎo)致的水腫及損傷[14,15]。已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[16，17]納洛酮對(duì)重度顱腦損傷、急性腦梗死患者有腦保護(hù)作用。本研究通過HE染色、穿梭箱實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Naloxone組大鼠的行為發(fā)生改變，學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善，海馬區(qū)正常形態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞明顯增多，存活神經(jīng)細(xì)胞比率增高。說明Naloxone對(duì)SAH所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷有明顯的改善作用。

綜上所述，SAH大鼠早期腦損傷對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力下降，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生損傷，凋亡細(xì)胞增多。Naloxone可減少海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善腦損傷，改善蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

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本文第一作者簡介：

孫林林 (1989—)，男，漢族，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：腦血管病