杜仲純中藥制劑和松脂醇二葡萄糖苷對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟微循環(huán)血流灌注及其頻譜特征的影響*

王 琴 張曉艷 劉雪婷 楊小杰 李愛玲 李宏偉 楊義力 韓建群, #

盡管在高血壓病預(yù)防和治療策略方面取得了巨大進步，但其仍然是目前世界范圍內(nèi)疾病負擔(dān)的重要危險因素之一[1,2]。幾乎所有確定的人類孟德爾型高血壓的致病基因都涉及到腎臟功能，而且大多數(shù)常用的高血壓動物模型都存在腎功能異常。腎臟只占人體總重量的1%，但在靜息狀態(tài)下，大約有20%的血液流向腎臟。微循環(huán)對于腎臟的功能至關(guān)重要，因為它在向腎臟微循環(huán)輸送氧氣方面起著關(guān)鍵作用[3,4]。激光多普勒血流探測儀(Laser Doppler Flowmetery, LDF)是一種可以對微循環(huán)血流灌注進行半定量檢測的儀器。小波分析(Wavelet analysis)是一種可對LDF血流灌注信號進行時頻分析的方法，可將不同生理機制對微血流灌注的影響區(qū)分開來，從而提供關(guān)于微血流灌注的更豐富的信息。

作為傳統(tǒng)中藥，杜仲具有廣泛的生物活性如抗高血壓、抗高血糖、預(yù)防骨質(zhì)疏松等[5,6]。松脂醇二葡萄糖苷(Pinoresinol Diglucoside,PDG)是杜仲的主要活性成分之一，也是杜仲藥材質(zhì)量控制的重要指標[7,8]。全杜仲膠囊(Total Eucommia Capsule,EU)是一種采用現(xiàn)代提取工藝制備而成的杜仲(100%杜仲皮)中成藥制劑，在輔助治療高血壓、骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎方面效果顯著[9,10]，但其具體作用機制目前尚不明確。本文旨在探討EU和PDG對SHRs腎臟微循環(huán)血流灌注及其頻譜特征的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、主要藥物、試劑和儀器

30只7-8周齡，體重180-190g的雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和6只正常血壓的Wistar Kyoto rats (WKYs)大鼠均購自北京維通利華實驗動物有限公司。所有動物飼養(yǎng)于12h晝夜交替，恒溫(23℃±2℃)恒濕(50%±10%)環(huán)境中，且自由飲食和進水。EU(批號200101，0.48g/粒，相當(dāng)于原藥材2.5g)由江西普正制藥股份有限公司提供。PDG(純度>98%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。雙通道激光多普勒血流檢測系統(tǒng)(Moor VMS，Moor Instruments公司)，配套VP4探頭，儀器配套分析軟件為Moor VMS PC 3.1。激光多普勒血流成像系統(tǒng)(moor LDI-HIR)為Moor Instruments公司產(chǎn)品，儀器配套軟件為mLDI 軟件Version 5.3。

1.2 動物分組及處理

動物分組：動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將30只SHRs隨機分為SHR組、SHR+EU組、SHR+PDG(L)組、SHR+PDG(M)組和SHR+PDG(H)組，每組6只。Control組為6只WKYs大鼠。

處理：Control組和SHR組純凈水灌胃。SHR+EU組：EU灌胃，生藥6g/kg[11]，臨用時稱取一定量的EU粉末，研磨，純凈水混懸。SHR+PDG共3組：PDG灌胃，其中低劑量(L)8.75mg/kg，中劑量(M)17.5mg/kg，高劑量(H)35mg/kg[12]。臨用時稱取一定量的PDG粉末，純凈水混懸。灌胃容量0.15ml/10g。上述干預(yù)均連續(xù)進行2個月，1次/日。

1.3 血壓測量

使用Softron BP-2010A智能無創(chuàng)血壓儀分別于治療前、治療1個月和治療2個月時測定大鼠尾動脈收縮壓(Systolic Blood Pressure,SBP)。具體操作如下：前一晚禁食不禁水，第二天白天于室溫下，在大鼠清醒、安靜時，將其放置于加熱套內(nèi)，暴露尾巴，將壓力傳感器按方向套于其尾巴根部，待加熱套升溫并穩(wěn)定在38℃約8min后，測量大鼠SBP。每只大鼠測量3次，取平均值。

1.4 LDF血流灌注、血流速度及血細胞聚集度檢測和激光多普勒血流成像分析

給藥2個月后，進行下述檢測。大鼠持續(xù)吸入2%異氟烷與50%O2+50%N2混合氣體進行麻醉后，取仰臥位，固定于操作臺，碘伏消毒腹部皮膚，腹部正中線切開，暴露腎臟。

1.4.1 腎臟血流灌注、血流速度和血細胞聚集度檢測：使用雙通道激光多普勒血流檢測系統(tǒng)捕獲腎臟微循環(huán)的LDF信號。微血管血流灌注單位(PU)用折線圖表示。采用Moor VMS PC 3.1分析微血流動力學(xué)參數(shù)的變化，包括平均血流灌注、血流速度和血細胞聚集度。

1.4.2 激光多普勒血流成像分析：使用激光多普勒血流成像系統(tǒng)進行腎臟的血流成像分析，采用儀器配套軟件mLDI Version 5.3分析血流灌注情況。儀器配套的數(shù)據(jù)分析軟件可直接輸出監(jiān)測期內(nèi)(2-3min)微血流動力學(xué)參數(shù)數(shù)值，選取較平穩(wěn)時段(1min)的均數(shù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 小波分析

雙通道LDF血流儀配套的Moor VMS PC 3.1分析軟件可將捕獲的正弦波式LDF信號轉(zhuǎn)換為Morlet小波。得到相應(yīng)指標的數(shù)值后，使LDF信號轉(zhuǎn)換成五個不同生理來源的特征頻段，即內(nèi)皮NO非依賴性內(nèi)皮源性(0.005-0.01Hz)、NO依賴性內(nèi)皮源性(0.02-0.05Hz)、神經(jīng)源性(0.02-0.05Hz)、肌源性(0.05-0.15Hz)、呼吸源性(0.15-0.4Hz)和心源性(0.4-2.0Hz)。輸出結(jié)果為包含時域和頻域信息的三維(3D)圖像，將小波系數(shù)矩陣沿時間軸平均，提取小波頻段-幅值二維圖[13]。由于內(nèi)皮細胞在調(diào)控微血管張力方面具有重要作用，故本研究選擇NO非依賴性和NO依賴性內(nèi)皮源性頻段信號進行觀察分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠SBP水平變化

治療前(8-9周齡)，各組大鼠SBP無顯著性差異(P>0.05)。治療1個月后(12-13周齡)和2個月后(16-17周齡)，與Control組比較，SHR組SBP顯著升高(t=6.67、5.37，P<0.01)。與SHR組比較，治療1個月后，SHR+EU組和SHR+PDG(H)組大鼠SBP顯著降低(t=2.40、2.75，P<0.05)，而SHR+PDG(L)組和SHR+PDG(M)組SBP變化無顯著差異(t均<1.90，P>0.05)。治療2個月后，SHR+EU組和各劑量PDG組大鼠SBP與SHR組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(t均<2.10，P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠SBP水平比較

2.2 各組大鼠腎臟微血流灌注水平比較

各組大鼠LDF血流灌注水平和LDPI血流灌注水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與Control組相比，SHR組大鼠腎臟呈現(xiàn)低血流灌注模式(t=14.13，P<0.01)。治療2個月后，與SHR組相比，SHR+EU組和SHR+PDG各劑量組的腎臟LDF血流灌注顯著升高(t>31.25,P<0.01)。與Control組相比，SHR組腎臟LDPI血流灌注顯著降低(t=5.08，P<0.01)。治療2個月后，與SHR組比較，SHR+EU組和SHR+PDG各劑量組(低劑量組除外)腎臟LDPI血流灌注顯著增加(t=7.22、5.72、10.23，P<0.01)。見圖1、表2。

表2 各組大鼠腎臟微血流灌注水平比較

注：A，各組LDF血流灌注折線圖；B，各組LDPI血流灌注圖

2.3 各組大鼠腎臟微循環(huán)血流速度和血細胞聚集度比較

各組大鼠腎臟微循環(huán)平均血流速度和血細胞聚集度水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與Control組比較，SHR組大鼠腎臟血流速度顯著降低(t=137.50，P<0.01)；與SHR組比較，SHR+EU組和SHR+PDG各劑量組的腎臟微血流速度顯著升高(t均>36.34，P<0.01)。SHR組腎臟微血管血細胞聚集度顯著高于Control組(t=32.25，P<0.01)；與SHR組比較，SHR+EU組和SHR+PDG各劑量組大鼠腎臟微血管血細胞聚集度則顯著降低(t均>33.00，P<0.01)。見圖2、表3。

表3 各組大鼠腎臟微循環(huán)平均血流速度和血細胞聚集度比較

注：A，各組腎臟微血流速度折線圖；B，各組腎臟血細胞聚集度折線圖

2.4 各組大鼠腎臟微循環(huán)血流灌注內(nèi)皮源性頻段幅值比較

與Control組相比，SHR組腎臟LDF信號頻譜圖特征峰分布規(guī)律明顯不同(圖3)；NO非依賴和NO依賴內(nèi)皮細胞源頻段幅值均顯著降低(t=9.91、5.51，P<0.01)。與SHR組相比，SHR+EU組和SHR+PDG中、高劑量組的NO依賴內(nèi)皮細胞源頻段幅值均顯著升高(t=4.58、9.47、7.95，P<0.01)(圖3，表4)。與SHR組相比，SHR+PDG中、高劑量組的NO非依賴內(nèi)皮細胞源頻段幅值均顯著升高(t=4.24、10.86，P<0.01)，而SHR+EU組和SHR+PDG(L)組該頻段幅值水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.07、0.03，P>0.05)(圖3，表4)。同時，三維時-頻圖顯示，SHR組大鼠腎臟內(nèi)皮細胞源(NO依賴性和NO非依賴性)頻段(箭頭示)幅值低于Control組,與SHR組比較,SHR+EU組和SHR+PDG各劑量組，尤其是中、高劑量腎臟內(nèi)皮細胞源頻段幅值明顯升高(圖4)。

表4 各組大鼠腎臟微血流灌注在內(nèi)皮源頻段小波系數(shù)絕對值的比較

圖3 各組大鼠腎臟微血流灌注信號在6個特征頻段的頻譜分布圖

圖4 各組大鼠腎臟微血流灌注信號在6個特征頻段的三維時-頻圖

3 討 論

本研究結(jié)果表明，與Control組比較，SHRs大鼠的腎臟微血流灌注水平和血流灌注LDF信號經(jīng)小波變換后的內(nèi)皮源性頻段幅值均顯著降低，EU和PDG可改善SHRs腎臟微血流灌注水平以及內(nèi)皮源性頻段幅值。

在中國，杜仲治療高血壓的歷史由來已久，前期的研究報道[15]，杜仲的總水提物或其中某些低含量物質(zhì)如PDG(30mg/kg)和京尼平苷酸(Geniposide Acid，GPA，30mg/kg)具有較理想的降壓效果[14]。然而，PDG和GPA在杜仲中的含量非常低(一般<0.3%)，并不能解釋為什么6g/kg的杜仲生藥就能使SHRs的血壓下降，表明杜仲的降壓作用可能是多種活性成分協(xié)同作用的結(jié)果。與前期研究結(jié)果一致[15,16]，本實驗結(jié)果也表明，EU和高劑量(35mg/kg)PDG治療一個月可顯著降低SHRs的血壓。出乎意料的是，治療兩個月后，SHRs血壓與未經(jīng)過治療的SHRs相比，雖然略微下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此結(jié)果可能與給藥方式和EU使用劑量有關(guān)，有待進一步研究。另外，目前臨床上，杜仲中藥制劑主要作為佐使藥聯(lián)合卡托普利或纈沙坦等治療高血壓[17-19]。

無論引發(fā)血壓升高的機制如何，長期高血壓最終將導(dǎo)致全身血管系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)的改變。這些變化既發(fā)生于大血管系統(tǒng)，也發(fā)生在微血管系統(tǒng)中。微血管網(wǎng)絡(luò)的充分灌注對于維持組織和器官功能的完整性至關(guān)重要，組織的氣體交換、營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)和代謝物的清除幾乎完全發(fā)生在微循環(huán)中。與高血壓相關(guān)的外周血管阻力的改變主要與微血管網(wǎng)絡(luò)的改變有關(guān)。70%—90%的全身動脈壓力被傳遞到微循環(huán)，因此，微循環(huán)系統(tǒng)對血流阻力的貢獻較大。高血壓時，小動脈和微動脈的功能性特征發(fā)生了很大改變，導(dǎo)致毛細血管灌注受損[20]。這種阻力升高的主要原因有：(1)小動脈和微動脈口徑變??；(2)小動脈和微動脈壁腔比增加；(3)小動脈或微動脈數(shù)量減少；(4)內(nèi)皮功能受損;(5)血液流動受損。此外，高血壓狀態(tài)下，微血管密度的降低也可能導(dǎo)致器官血流量減少和器官間血液重新分配，從而阻礙器官代謝營養(yǎng)物質(zhì)的交換[21,22]。本研究結(jié)果表明，與血壓正常的WKYs大鼠相比，SHRs大鼠腎臟微血流灌注水平和微血流速度顯著降低。高血壓時，人體內(nèi)紅細胞的機械和生化特性發(fā)生了改變。原發(fā)性高血壓患者的SBP、DBP、MAP的升高以及左心室質(zhì)量的增加與紅細胞聚集度增加有關(guān)[23]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，SHRs腎臟血細胞聚集度顯著高于血壓正常的WKYs。EU和各劑量PDG治療兩個月可顯著提高SHRs腎臟微血流灌注、血流速度并降低血細胞聚集度。表明EU和PDG對高血壓導(dǎo)致的腎臟微循環(huán)功能障礙具有保護作用。

小波分析在高頻率時具有良好的時間分辨率，在低頻率時具有良好的頻率分辨率。這種多分辨率時頻分析已被證明是一種分析非平穩(wěn)生物信號的好方法，例如肌電信號和皮膚血流信號。在時域和頻域分辨率達到最優(yōu)的前提下，小波分析可將LDF血流灌注振蕩轉(zhuǎn)換為五個特征頻段，其中每個頻段代表不同生理調(diào)節(jié)機制。微血管內(nèi)皮細胞是微循環(huán)的基本功能單元，其與周細胞協(xié)同作用調(diào)控微血管管徑和微血管的舒縮，進而調(diào)控器官血流灌注水平和功能狀態(tài)。本研究比較了各組大鼠腎臟血流灌注LDF信號經(jīng)過小波變換后的頻譜特征，結(jié)果顯示，與WKYs大鼠相比，SHRs大鼠的腎臟內(nèi)皮源性頻段幅值顯著降低，EU和PDG治療可使該幅值顯著升高，表明EU和PDG對高血壓時腎臟微血管內(nèi)皮細胞具有保護作用。

綜上所述，SHRs腎臟存在微血流動力學(xué)異常和內(nèi)皮功能障礙，EU和PDG治療后可顯著改善SHRs腎臟的微血流動力學(xué)和內(nèi)皮功能。

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本文第一作者簡介：

王 琴(1984-)，女，漢族，助理研究員，研究方向：微血管內(nèi)皮功能障礙