TMB 表達(dá)水平對(duì)EGFR突變晚期NSCLC患者預(yù)后分析

高 崢，宋春青，張 穎，郭宏偉，司蓮蓮，趙麗波

(首都醫(yī)科大學(xué)大興教學(xué)醫(yī)院 腫瘤科，北京102600)

肺癌在我國(guó)發(fā)病率和死亡率均居首位，并且發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，患者趨年輕化，預(yù)后也較差[1-2]。原發(fā)性肺癌中約80%為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，隨著致癌驅(qū)動(dòng)基因如表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、c-ros癌基因1(ROS1)等的相繼發(fā)現(xiàn)，基于驅(qū)動(dòng)基因的靶向治療藥物大大延長(zhǎng)了非小細(xì)胞肺癌患者的生存期。相比西方國(guó)家，亞裔人群和我國(guó)的NSCLC患者EGFR基因敏感突變陽(yáng)性率更高，達(dá)40%-50%，其中不吸煙者、女性尤高[3]。因此，EGFR是肺癌治療中最重要的靶點(diǎn)。一代、二代和三代 EGFR-TKI是目前EGFR 突變型IV期NSCLC患者的一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案，可以取得較高的客觀緩解率(70%左右)和9-18個(gè)月的中位PFS，但仍有部分EGFR驅(qū)動(dòng)基因陽(yáng)性的患者療效及預(yù)后不佳，因此，尋求此類患者TKI治療獲益的預(yù)測(cè)因子和標(biāo)記物可對(duì)臨床決策產(chǎn)生積極影響。

腫瘤突變負(fù)荷(TMB)是一個(gè)具有良好前景的全新生物標(biāo)記物。TMB被定義為腫瘤基因組中每百萬(wàn)堿基中被檢測(cè)出的，體細(xì)胞基因編碼錯(cuò)誤、堿基替換、基因插入或缺失錯(cuò)誤的總數(shù)。多項(xiàng)研究提示，高TMB患者對(duì)免疫治療應(yīng)答更強(qiáng)，對(duì)肺癌[4]、黑色素瘤[5]等惡性腫瘤的免疫治療均有預(yù)測(cè)作用。國(guó)外部分?jǐn)?shù)據(jù)顯示TMB數(shù)值的高低可能與EGFR驅(qū)動(dòng)基因突變患者的預(yù)后相關(guān)，本研究采用回顧性研究，分析真實(shí)世界中晚期NSCLC患者治療前TMB的表達(dá)水平及其與EGFR突變患者的預(yù)后相關(guān)性，揭示TMB是否在靶向治療中亦存在預(yù)測(cè)作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性納入2015年1月至2021年1月在首都醫(yī)科大學(xué)大興教學(xué)醫(yī)院確診的95例初治晚期NSCLC患者。組織學(xué)分類依據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)(2015年版)[6]。肺癌分期按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)第8版TNM分期進(jìn)行。研究方案經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)大興教學(xué)醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。選擇納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)原發(fā)或轉(zhuǎn)移病灶穿刺活檢或手術(shù)切除組織病理確診為肺腺癌或含腺癌成分的肺鱗癌，第8版國(guó)際抗癌聯(lián)盟分期標(biāo)準(zhǔn)為Ⅳ期；②年齡≥18歲；③含EGFR驅(qū)動(dòng)基因敏感突變(19DEL或21L858R)，且一線治療給予EGFR-TKIs藥物，用藥時(shí)間至少30 d以上；④患者診斷時(shí)已行組織TMB檢測(cè)并可以獲得完整的病歷資料。主要排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他原發(fā)性惡性腫瘤；②無(wú)法獲取病理組織、Ⅰ-Ⅲ期患者或合并嚴(yán)重并發(fā)癥、心肝腎等嚴(yán)重臟器功能障礙有TKI藥物治療禁忌者。截止2021年1月，共納入95例患者，其中男52例，女43例；年齡(63.69±9.37歲)；病理類型：腺癌92例，鱗癌1例，腺鱗癌2例。

1.2 方法

1.2.1EGFR-TKIs靶向治療 所有患者一線治療接受單藥EGFR-TKI治療，可選擇吉非替尼250 mg(1片)，1日1次，或鹽酸?？颂婺?25 mg(1片)，1日3次，或甲磺酸奧希替尼80 mg(1片)，1日1次。直至患者腫瘤疾病進(jìn)展或出現(xiàn)無(wú)法耐受的治療毒性。最常見(jiàn)的毒副作用為皮疹、腹瀉和藥物性肝損傷，NCICTCAE2級(jí)或2級(jí)以上的ALT、AST升高，NCICTCAE3級(jí)或3級(jí)以上的腹瀉、皮疹，允許暫停TKIs治療至下降至0-1級(jí)后再次應(yīng)用，出現(xiàn)藥物相關(guān)的間質(zhì)性肺疾病，重度肝損傷等重度毒性時(shí)給予終止TKI治療并更換治療方案。

1.2.2臨床資料采集 從電子病歷中提取患者的臨床和治療信息，包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤分期、病理類型、具體治療方案、無(wú)進(jìn)展生存期等。根據(jù)實(shí)體腫瘤Recist 1.1版療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)螺旋CT或磁共振成像掃描對(duì)所有患者進(jìn)行影像學(xué)評(píng)價(jià)。無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)被定義為從首次用藥到第一次疾病進(jìn)展或因任何原因死亡的日期。采用門(mén)診或電話隨訪，本研究最后一次隨訪時(shí)間為2022年3月1日。

1.2.3TMB檢測(cè) 所有穿刺組織或手術(shù)切除組織離體后用中性緩沖福爾馬林固定。為保證TMB檢測(cè)結(jié)果的可靠性，要求送檢3個(gè)月以內(nèi)的蠟塊組織。病理質(zhì)控達(dá)標(biāo)后，使用QIAGEN試劑盒從10至15張5 μm厚的腫瘤FFPE組織的未染色切片中提取基因組DNA。應(yīng)用通用試劑盒KAPA Hyper Prep試劑盒進(jìn)行DNA文庫(kù)制備，然后采用定制的xGen鎖定探針進(jìn)行雜交富集，探測(cè)面板的設(shè)計(jì)目標(biāo)是425個(gè)癌癥特異性基因，采用目標(biāo)區(qū)域探針捕獲技術(shù)，在Illumina Hiseq4000 NGS平臺(tái)上擴(kuò)增富集的文庫(kù)并進(jìn)行NGS檢測(cè)。TMB定義為每1Mb檢測(cè)的基因組中的體細(xì)胞突變數(shù)，統(tǒng)計(jì)的突變包括錯(cuò)義、同義、移碼、剪接位點(diǎn)突變，排除了EGFR和ALK等肺癌驅(qū)動(dòng)基因的激酶結(jié)構(gòu)域。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier方法對(duì)高TMB、中低TMB組的PFS進(jìn)行生存分析，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)影響PFS的預(yù)后因素進(jìn)行多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMB表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

在納入標(biāo)準(zhǔn)的95例EGFR突變的晚期NSCLC患者中，中位TMB值為5.2 muts/Mb(2.0-16.2 muts/Mb)，通過(guò)三分位法分為高TMB組(TMB>6.1 muts/Mb)、中TMB組(4.5-6.1 muts/Mb)和低TMB組(<4.5 muts/Mb)。其中高TMB組患者的ORR為59.38%(19/32)，顯著低于中、低TMB組(ORR為84.13%(53/63))，χ2值7.086，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。21L858R突變患者51例，TMB均值為7.026±4.076 muts/Mb，19DEL突變患者44例，TMB均值為5.336±2.004 muts/Mb，21L858R突變患者TMB表達(dá)水平高于19DEL患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)。大多數(shù)人為一代TKI治療患者，其中吉非替尼組患者最多，占70.5%(67/95)，鹽酸?？颂婺峤M其次，占25.3%(24/95)，三代TKI均為甲磺酸奧希替尼，占4.2%(4/95)。TMB表達(dá)水平與性別、年齡、是否吸煙、病理類型均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表1 TMB表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

2.2 生存分析

Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，高TMB組的中位PFS為7.2m(95%CI 4.570-9.830)，中、低TMB組患者中位PFS為11.2m，(95%CI 10.300-12.100)，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)(圖1)。與19DEL突變患者相比，21L858R突變患者中位PFS更短，為9.3m(95%CI 7.665-10.935)vs 11.2m(95%CI 9.550-12.850)，但二者無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.072)(圖2)。

圖1 高TMB與中、低TMB的PFS Kaplan-Meier生存曲線圖

圖2 21L858R突變患者與19DEL突變患者的PFS Kaplan-Meier生存曲線圖

2.3 影響NSCLC患者PFS的預(yù)后因素分析

對(duì)可能影響預(yù)后的臨床病理特征進(jìn)行單因素和多因素回歸分析(表2)。單因素分析顯示以下3個(gè)因素與PFS有關(guān)：EGFR突變狀態(tài)(P=0.031)、吸煙(P=0.038)、TMB表達(dá)水平(P=0.001)。多因素分析顯示以下2個(gè)影響PFS的獨(dú)立預(yù)后因素：吸煙(HR=1.838，95%CI：1.072-3.151，P=0.027)、TMB表達(dá)水平(HR=2.518，95%CI：1.468-4.319，P=0.001)。

表2 影響NSCLC患者PFS的單因素和多因素分析

3 討論

既往研究證實(shí)TMB高與免疫治療預(yù)后呈正相關(guān)[5、7-8]。2015年，Science發(fā)表了首個(gè)探索TMB與NSCLC免疫治療療效的研究[4]，該研究指出高TMB的NSCLC患者接受免疫治療的臨床獲益持久率(DCB)明顯高于低TMB患者，且不論P(yáng)D-L1表達(dá)狀態(tài)。多項(xiàng)大型臨床研究，如CheckMate-026、CheckMate-22等也證實(shí)了高TMB患者在肺癌ICIs有效性增加。從機(jī)制上講，TMB-H的腫瘤突變數(shù)量增加，這些癌細(xì)胞中異常基因編碼的肽段可被細(xì)胞表面的主要組織相容物(MHC)加工和遞呈，形成腫瘤新生抗原，并被機(jī)體內(nèi)的T細(xì)胞識(shí)別，從而提高ICIs的治療敏感性。研究表明，TMB在驅(qū)動(dòng)基因陽(yáng)性的患者顯著降低[9]，可能原因?yàn)閺?qiáng)勢(shì)驅(qū)動(dòng)基因突變抑制其他非同義突變的產(chǎn)生。而在靶向治療中，有研究顯示TKI耐藥后患者TMB水平明顯升高[10]，可能因?yàn)樵诎邢蛑委煹倪x擇性壓力下出現(xiàn)多樣性亞克隆和耐藥通路增加相關(guān)。

Offin等[10]評(píng)價(jià)了153名轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌TMB水平對(duì)靶向治療的預(yù)測(cè)價(jià)值，發(fā)現(xiàn)中、低TMB組的治療終止時(shí)間(TTD)和總生存(OS)顯著長(zhǎng)于高TMB組，且低TMB組更多繼發(fā)T790M突變，首次證實(shí)TMB與NSCLC患者接受EGFR-TKI治療的臨床獲益呈負(fù)相關(guān)。作為第一個(gè)報(bào)道TMB與EGFR-TKI治療預(yù)后的研究，這項(xiàng)研究靶向治療未納入三代TKI藥物從而未能給出TMB對(duì)三代TKI療效的預(yù)測(cè)作用，其次，研究者選擇TTD作為療效衡量指標(biāo)，而未采用在評(píng)估藥物療效方面更有說(shuō)服力的PFS。

臧遠(yuǎn)勝教授團(tuán)隊(duì)[11]篩選癌癥基因組圖譜中289例EGFR突變型NSCLC患者的基因突變和生存時(shí)間信息，結(jié)果顯示高TMB組OS時(shí)間短于低TMB組(24.03個(gè)月vs未達(dá)到，P=0.0020)，是EGFR突變型晚期肺腺癌的獨(dú)立不良預(yù)后因素，但是，該研究的數(shù)據(jù)源于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，無(wú)法獲得具體治療方案，因此無(wú)法給出TMB對(duì)EGFR-TKI療效的預(yù)測(cè)價(jià)值。

目前尚沒(méi)有公認(rèn)的區(qū)分高、低TMB的cut-off值，考慮到諸多局限性因素，如：NGS公司眾多，檢測(cè)技術(shù)各有千秋，測(cè)序平臺(tái)參數(shù)不盡相同，NGS panel、TMB計(jì)算方法也各有差異，使得各家的結(jié)果短期內(nèi)難以統(tǒng)一化、標(biāo)準(zhǔn)化。腫瘤突變負(fù)荷應(yīng)用于肺癌免疫治療的專家共識(shí)[12]推薦各研究可根據(jù)各自臨床研究數(shù)據(jù)確定cut-off值，并進(jìn)行前瞻性驗(yàn)證。本研究參照一系列評(píng)價(jià)TMB在免疫治療中的價(jià)值的經(jīng)典文獻(xiàn)，采用三分位法確定TMB cut-off值。本研究結(jié)果提示，相比高TMB組，中低TMB組患者接受靶向治療后的ORR、中位PFS明顯延長(zhǎng)，提示預(yù)后更優(yōu)。與19del突變患者相比，L858R突變患者TMB更高，中位PFS更短，為9.3m(95%CI 7.665-10.935)vs 11.2m(95%CI 9.550-12.850)，這與既往報(bào)道相符[13]。同時(shí)多因素分析發(fā)現(xiàn)吸煙患者的PFS更短，也是影響PFS的負(fù)向獨(dú)立預(yù)后因素，可能與煙草暴露誘發(fā)基因突變?cè)黾酉嚓P(guān)。然而，本研究同樣存在一定缺陷，包括：研究類型并非是具有更高級(jí)別循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的前瞻性研究，樣本量較少，尤其三代TKIs病例數(shù)較少，不能了解是否三代TKI的應(yīng)用可以改善高TMB患者的預(yù)后，且未同時(shí)納入OS數(shù)據(jù)以分析中國(guó)人群與預(yù)后的關(guān)系等。由于NGS使我們能夠全面了解非小細(xì)胞肺癌的遺傳狀況，因此在分析TMB與EGFR-TKIs臨床益處的相關(guān)性時(shí)，可能將其他合并突變一并納入并加以分析會(huì)更加客觀。