基于熒光免疫層析技術(shù)的孕激素定量檢測(cè)儀

張長(zhǎng)亮，龐春穎，郝浙吉

（長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

根據(jù)《醫(yī)藥論壇雜志》，我國(guó)新生兒每年出生數(shù)量在1 600～2 000萬(wàn)之間，我國(guó)女性自然流產(chǎn)人數(shù)在總?cè)焉锶藬?shù)中占10%～15%［1］。其中，由黃體內(nèi)分泌不足引起的流產(chǎn)占自然流產(chǎn)的20%～58%，所以對(duì)于早期孕婦體內(nèi)的孕激素各項(xiàng)指標(biāo)的監(jiān)測(cè)具有重要意義。目前，對(duì)于孕激素的檢測(cè)主要采用化學(xué)免疫發(fā)光技術(shù)和膠體金免疫技術(shù)［2］?；瘜W(xué)免疫發(fā)光技術(shù)檢測(cè)精度高，技術(shù)成熟，但檢測(cè)系統(tǒng)復(fù)雜，常用于醫(yī)院大型檢測(cè)設(shè)備，如羅氏COBAS 8000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀、貝克曼DXI800免疫分析儀。膠體金免疫技術(shù)基于膠體金的顯色反應(yīng)，儀器便攜性強(qiáng)，但只能進(jìn)行定性或半定量檢測(cè)，達(dá)不到臨床檢測(cè)指標(biāo)濃度的需求。

熒光免疫層析技術(shù)［3］在定量檢測(cè)領(lǐng)域擁有良好的應(yīng)用前景，該檢測(cè)方法主要包括光電檢測(cè)法和成像式檢測(cè)法。成像式檢測(cè)法［4］利用CCD獲取熒光圖像法，進(jìn)行熒光提取、分析。徐笑晗等人［5］使用CCD和手持顯微鏡設(shè)計(jì)熒光成像檢測(cè)系統(tǒng)，采集熒光圖像，利用圖像平均灰度值計(jì)算熒光強(qiáng)度。相對(duì)于成像式法，光電檢測(cè)法［6-7］避免了圖像采集及熒光信號(hào)算法提取等復(fù)雜操作過(guò)程，通過(guò)光電探測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)［8-10］，并通過(guò)放大電路、濾波電路對(duì)信號(hào)進(jìn)行模擬處理，但該方法對(duì)機(jī)械掃描穩(wěn)定性要求高，且容易受到環(huán)境光干擾。

本文研發(fā)一款基于熒光免疫層析技術(shù)的便攜式孕激素定量檢測(cè)儀，設(shè)計(jì)共聚焦式光學(xué)檢測(cè)光路系統(tǒng)，有效降低熒光信號(hào)的干擾，實(shí)現(xiàn)孕激素定量檢測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，改善膠體金類(lèi)檢測(cè)儀對(duì)孕激素濃度定性或半定量檢測(cè)問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)家用便攜式儀器對(duì)孕激素濃度的定量檢測(cè)。

1 熒光免疫層析技術(shù)檢測(cè)原理

熒光免疫層析技術(shù)是一種基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的新型膜檢測(cè)技術(shù)，該檢測(cè)技術(shù)采用熒光素標(biāo)記待檢測(cè)抗原或抗體，檢測(cè)試紙條以檢測(cè)T線、質(zhì)控C線的條形纖維層析材料為固相，測(cè)試液為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)選用的熒光免疫層析檢測(cè)卡采用雙抗體夾心法研制，檢測(cè)時(shí)將待檢測(cè)液體滴加至樣品墊，檢測(cè)液中的待檢測(cè)物與玻璃纖維樣品墊上的熒光標(biāo)記物結(jié)合，被熒光標(biāo)記物標(biāo)記的抗原經(jīng)毛細(xì)管作用流經(jīng)硝酸纖維素膜（NC膜），流經(jīng)檢測(cè)T線處時(shí)，結(jié)合物中的檢測(cè)抗原與抗體Y1相結(jié)合，被滯留在檢測(cè)T線處。未與檢測(cè)物結(jié)合的熒光標(biāo)記物流經(jīng)檢測(cè)T線，到達(dá)質(zhì)控C線處時(shí)與抗抗體Y2相結(jié)合，滯留在質(zhì)控C線處。熒光標(biāo)記物在激發(fā)光的照射下，產(chǎn)生微弱的熒光，熒光強(qiáng)度與檢測(cè)物質(zhì)濃度成正相關(guān)關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)T線和C線產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，進(jìn)而計(jì)算被檢測(cè)樣品的濃度值，檢測(cè)原理圖如圖1所示。

2 孕激素定量檢測(cè)儀設(shè)計(jì)

儀器的設(shè)計(jì)基于熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)激發(fā)并檢測(cè)已滴加樣品試劑卡上的熒光信號(hào)，通過(guò)處理熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)孕激素濃度的檢測(cè)。便攜式孕激素定量檢測(cè)儀主要包括光學(xué)系統(tǒng)和電控系統(tǒng)兩部分。

2.1 光學(xué)系統(tǒng)

光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可靠性是熒光免疫檢測(cè)儀的核心保證，其檢測(cè)精度影響系統(tǒng)最終檢測(cè)結(jié)果，在檢測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)中起決定作用。本文設(shè)計(jì)共聚焦式光學(xué)結(jié)構(gòu)的激發(fā)與熒光檢測(cè)光路，結(jié)構(gòu)圖如圖2所示，可實(shí)現(xiàn)激發(fā)與檢測(cè)共光路工作，結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單、光線損失少、抗干擾性強(qiáng)、大幅提高實(shí)驗(yàn)檢測(cè)精度。

圖2 共聚焦式光學(xué)結(jié)構(gòu)原理圖

共聚焦式光學(xué)檢測(cè)光路工作原理如下：電控系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)光源產(chǎn)生熒光信號(hào)的激發(fā)光，激發(fā)光經(jīng)準(zhǔn)直鏡平行射入檢測(cè)光路；濾光片濾除特定波長(zhǎng)范圍以外的雜光，保證激發(fā)光源的單色性；二向色鏡與激發(fā)光線呈45°夾角，將激發(fā)光反射到檢測(cè)卡區(qū)域；聚焦鏡將激發(fā)線匯聚到檢測(cè)試劑卡上。熒光標(biāo)記物在激發(fā)光的作用下產(chǎn)生熒光信號(hào)；熒光經(jīng)過(guò)聚焦鏡到達(dá)二向色鏡，二向色鏡對(duì)熒光波長(zhǎng)的光具有透射作用，熒光信號(hào)透過(guò)二向色鏡；濾光片濾除熒光波長(zhǎng)范圍以外的雜光；熒光信號(hào)經(jīng)聚焦鏡匯聚到光電探測(cè)器的接收面，實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光信號(hào)的采集；采集到的熒光信號(hào)經(jīng)電控系統(tǒng)進(jìn)行模擬信號(hào)處理。

系統(tǒng)設(shè)計(jì)數(shù)控恒流源驅(qū)動(dòng)電路實(shí)現(xiàn)光照強(qiáng)度調(diào)節(jié)，選用型號(hào)為CUN66A1B的UVLED作為激發(fā)光源，發(fā)射以365 nm為中心波長(zhǎng)的激發(fā)光；選用型號(hào)為FB360-10的激發(fā)濾光片，濾除雜光對(duì)激發(fā)光源的干擾；選用型號(hào)為MDSP425R的二向色鏡，對(duì)波長(zhǎng)410 nm波段以下的光線反射率大于95%，對(duì)440 nm波段以上的光線透射率大于90%；聚焦鏡1孔徑為10 mm，焦距為10 mm；采集濾光片選用型號(hào)為FB610-10，濾除檢測(cè)熒光信號(hào)波段以外的光線；聚焦鏡2孔徑為10 mm，焦距為10 mm；選用型號(hào)為BPW21的硅光電二極管作為光電探測(cè)器，光譜響應(yīng)范圍在350～820 nm，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的接收。本文設(shè)計(jì)的檢測(cè)光路結(jié)構(gòu)圖如圖3所示。

圖3 系統(tǒng)檢測(cè)光路結(jié)構(gòu)圖

檢測(cè)光路設(shè)計(jì)時(shí)考慮到機(jī)械結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及易裝調(diào)性等因素，透鏡間采用隔圈保證間隔尺寸，采用壓圈進(jìn)行固定，鏡筒通過(guò)環(huán)形圈固定座固定于外殼底部。二向色鏡采用UV膠固定在L型鏡座上，鏡座通過(guò)螺釘固定于外殼底部，二向色鏡與檢測(cè)光路呈45°夾角。

系統(tǒng)采用固定光學(xué)檢測(cè)結(jié)構(gòu)，通過(guò)步進(jìn)電機(jī)推動(dòng)檢測(cè)卡移動(dòng)，檢測(cè)卡槽的內(nèi)部設(shè)計(jì)彈片結(jié)構(gòu)，當(dāng)檢測(cè)卡小于檢測(cè)卡槽寬度時(shí)，可通過(guò)彈片進(jìn)行固定，減少因檢測(cè)時(shí)檢測(cè)卡的不穩(wěn)定移動(dòng)造成的干擾?？ú鄣鬃O(shè)計(jì)圖如圖4所示。

圖4 卡槽底座設(shè)計(jì)圖

系統(tǒng)檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)樣品滴加至檢測(cè)卡樣品墊處，將檢測(cè)卡插入檢測(cè)卡槽內(nèi)，通過(guò)步進(jìn)電機(jī)推動(dòng)滑塊系統(tǒng)，將檢測(cè)卡檢測(cè)條帶勻速經(jīng)過(guò)光學(xué)檢測(cè)區(qū)域，完成對(duì)檢測(cè)卡待測(cè)物質(zhì)的熒光信號(hào)激發(fā)與采集工作。光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)整體設(shè)計(jì)如圖5所示。

圖5 光學(xué)系統(tǒng)整體設(shè)計(jì)圖

2.2 電控系統(tǒng)

電控系統(tǒng)的設(shè)計(jì)主要包括主控芯片最小系統(tǒng)電路、激發(fā)及檢測(cè)熒光信號(hào)電路、信號(hào)I/V轉(zhuǎn)換及放大濾波電路、步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)電路和人機(jī)交互接口電路的設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)控制電路以及與各模塊之間的硬件聯(lián)系。系統(tǒng)硬件電路設(shè)計(jì)框圖如圖6所示。

圖6 系統(tǒng)硬件電路設(shè)計(jì)

系統(tǒng)電路的設(shè)計(jì)中，各功能模塊資源分配如下：采用 PA9、PA10的 USART1功能，通過(guò)CH340G芯片構(gòu)成USB轉(zhuǎn)串口一鍵下載電路，實(shí)現(xiàn)程序的調(diào)試與下載，觸摸屏通信采用跳線帽轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)與USB轉(zhuǎn)換電路共用USART1，進(jìn)行指令發(fā)送與接收；采用PA2、PA3的USART2功能，通過(guò)SPS3232芯片構(gòu)成TTL與RS232信號(hào)轉(zhuǎn)換，驅(qū)動(dòng)熱敏打印機(jī)進(jìn)行走紙打??；采用PG9、PG14的USART6功能，連接掃描模塊，TTL電平信號(hào)驅(qū)動(dòng)掃描模塊工作；采用PA6、PA7的TIM3功能，用于控制步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)步數(shù)以及ADC采樣時(shí)間控制；采用 PB6、PB7、PB8、PB9的 TIM4功能，產(chǎn)生四路PWM波驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)運(yùn)行；采用PF7的ADC3功能，對(duì)輸入的模擬信號(hào)進(jìn)行12位模數(shù)轉(zhuǎn)換；采用PF0、PF1的IIC通信功能，向24C02芯片寫(xiě)入或讀取檢測(cè)數(shù)據(jù)。

電控系統(tǒng)程序的設(shè)計(jì)主要包括儀器上電時(shí)系統(tǒng)各參數(shù)指標(biāo)初始化，各項(xiàng)指令接收與數(shù)據(jù)發(fā)送，并執(zhí)行相應(yīng)功能，實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的有序運(yùn)作。系統(tǒng)上電后，主程序調(diào)用初始化函數(shù)，對(duì)單片機(jī)I/O口、復(fù)用映射、定時(shí)器、串口、中斷及中斷優(yōu)先級(jí)等參數(shù)進(jìn)行初始化設(shè)置。系統(tǒng)對(duì)各項(xiàng)參數(shù)初始化完成后，進(jìn)入等待指令模式，并對(duì)接收到的指令進(jìn)行判斷，接收到完成指令，并對(duì)指令解析，執(zhí)行相應(yīng)功能。系統(tǒng)主程序執(zhí)行的功能主要包括觸摸屏通信、用戶登錄、檢測(cè)條碼信息掃描、步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)信號(hào)輸出、熒光信號(hào)采集與處理、檢測(cè)結(jié)果保存以及對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行打印。系統(tǒng)主程序工作流程圖如圖7所示。

圖7 系統(tǒng)主程序流程圖

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

采用孕激素定量檢測(cè)儀對(duì)孕酮素濃度進(jìn)行檢測(cè)與分析，并與美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)的DXI800全自動(dòng)免疫分析儀作對(duì)比分析。本文設(shè)計(jì)的孕激素定量檢測(cè)儀實(shí)物圖如圖8所示。

圖8 便攜式孕激素定量檢測(cè)系統(tǒng)

3.1 檢測(cè)物質(zhì)濃度表達(dá)式擬合

為得到檢測(cè)熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度之間的關(guān)系，配置 12組濃度為 0、1.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、30.0 ng/mL、40.0 ng/mL、50.0 ng/mL、60.0 ng/mL、70.0 ng/mL、80.0 ng/mL、90.0 ng/mL、100.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液樣品，滴入檢測(cè)試劑卡樣品墊檢測(cè)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的熒光信號(hào)與待測(cè)樣品濃度的數(shù)據(jù)，采用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，所得關(guān)系表達(dá)式為：

式中，y為檢測(cè)物質(zhì)濃度；x為熒光強(qiáng)度特征值。線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，儀器在 0～100 ng/mL 濃度檢測(cè)范圍內(nèi)，孕酮素濃度與熒光信號(hào)強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系，可實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)物質(zhì)濃度的計(jì)算，其特性曲線如圖9所示。

圖9 孕酮素濃度與及熒光信號(hào)強(qiáng)度特性曲線

3.2 重復(fù)性測(cè)試

配置標(biāo)準(zhǔn)液濃度為5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、15.0 ng/mL三種濃度指標(biāo)進(jìn)行測(cè)試，每組測(cè)試重復(fù)10次，并計(jì)算檢測(cè)樣本濃度均值以及標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)重復(fù)性變異系數(shù)計(jì)算公式

式中，CV為變異系數(shù)；σ為樣本標(biāo)準(zhǔn)差；為樣本平均值。計(jì)算出三種濃度指標(biāo)重復(fù)性測(cè)試變異系數(shù)分別為3.7%、2.8%、1.2%，系統(tǒng)變異系數(shù)小于4%，其特性曲線如圖10所示，具有較好的可重復(fù)性，并且隨著檢測(cè)濃度的升高，變異系數(shù)越小，系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果越穩(wěn)定。

圖10 樣本重復(fù)性測(cè)試曲線圖

3.3 誤差測(cè)試

根據(jù)標(biāo)定曲線對(duì)儀器檢測(cè)誤差進(jìn)行測(cè)試，配置10組濃度的樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與貝克曼檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的誤差，對(duì)比結(jié)果如表1所示。

表1 孕酮素對(duì)比測(cè)試數(shù)據(jù)表

由表1所知，檢測(cè)結(jié)果中誤差最大為4.5%，符合醫(yī)學(xué)儀器設(shè)計(jì)儀器誤差不得超過(guò)10%的規(guī)定。因此，該儀器檢測(cè)精確度較好、靈敏度高，滿足臨床應(yīng)用要求。

4 結(jié)論

本文采用光電檢測(cè)法，設(shè)計(jì)共聚焦式光學(xué)檢測(cè)結(jié)構(gòu)，研發(fā)一款基于熒光免疫層析技術(shù)的孕激素定量檢測(cè)儀，儀器選用STM32F407微處理器作為系統(tǒng)控制核心，實(shí)現(xiàn)對(duì)女性尿液中孕激素含量的定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文設(shè)計(jì)的便攜式孕激素檢測(cè)儀能夠?qū)υ屑に刂笜?biāo)進(jìn)行定量檢測(cè)，并達(dá)到臨床對(duì)指標(biāo)檢測(cè)濃度的要求，相對(duì)于膠體金檢測(cè)法，該儀器可實(shí)現(xiàn)對(duì)孕激素濃度的定量檢測(cè)。系統(tǒng)具有檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高、尿檢無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，具有較高的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)發(fā)展空間。