尤瑞克林對(duì)急性腦梗死大鼠保護(hù)作用及機(jī)制研究

馬 寧， 楊永利， 張雙鶴， 丁 亮， 閆思蒙

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 干一科，遼寧 沈陽(yáng)110016；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110000

腦卒中是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，病死率和致殘率極高。 其中，急性缺血性腦卒中較為常見，約占腦卒中總數(shù)的80%[1]，其發(fā)生與高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、吸煙、肥胖和血脂異常等有關(guān)[2-3]。 急性缺血性腦卒中的治療主要包括超急性期的恢復(fù)灌注治療、抗血小板和卒中單元治療，尚缺少其他有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持的治療手段[4]。 急性缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)治療一直是國(guó)際研究的熱點(diǎn)。 然而，動(dòng)物研究中證實(shí)有效的神經(jīng)保護(hù)藥物尚未成功轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用中。 尤瑞克林(Ureklin，HUK)是國(guó)家Ⅰ類新藥，廣泛應(yīng)用于急性腦梗死的治療。 HUK 可以增加缺血后內(nèi)源性組織激肽釋放酶表達(dá)，有效地促進(jìn)局部血管再生，有助于急性腦梗死伴3 級(jí)高血壓或心房顫動(dòng)的恢復(fù)[5]。 有研究表明，HUK 可以激活激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，誘導(dǎo)缺血腦組織釋放一氧化氮，松弛血管平滑肌，使缺血區(qū)血管擴(kuò)張，改善半暗帶腦供血，恢復(fù)神經(jīng)功能缺損[6]。 此外，HUK 還可以通過(guò)增加缺血半暗帶局部腦血流量，誘導(dǎo)梗死周圍的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管和神經(jīng)再生，開放側(cè)支循環(huán)，顯著減少大鼠腦缺血再灌注后24 h 腦梗死面積和神經(jīng)缺損[7]。 本研究旨在探討HUK 對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠的保護(hù)作用機(jī)制。 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 30 只雄性健康SD 大鼠，6 周齡，體質(zhì)量280 ~300 g，購(gòu)自本溪長(zhǎng)生生物科技有限公司。 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham 組)、MCAO 組和動(dòng)脈泵入HUK 組(HUK 組)，每組各10 只。MCAO 組:建立永久性MCAO 大鼠模型。HUK 組:永久性MCAO 大鼠模型建立后30 min，經(jīng)動(dòng) 脈 泵 入 HUK ( 15.625 × 10-4PNAU/kg)。Sham 組:線栓淺插入，不堵塞大腦中動(dòng)脈，其余手術(shù)步驟與MCAO 組相同。 每籠飼養(yǎng)5 只大鼠，在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下(室溫20℃±2℃，12 h 明暗周期)自由獲取食物和水。 本研究按醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)制定的倫理規(guī)定進(jìn)行。

1.2 MCAO 模型建立 操作過(guò)程參考文獻(xiàn)[8]。將麻醉后的大鼠仰臥位固定，沿頸前正中線作長(zhǎng)約2.5 cm 切口，鈍性剝離皮下組織，顯露胸鎖乳突肌和胸骨舌骨?。谎匦劓i乳突肌和胸骨舌骨肌之間的間隙向下剝離，顯露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈；分離頸內(nèi)動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈，注意避免損傷迷走神經(jīng)；分離頸外動(dòng)脈及其分支枕動(dòng)脈和甲狀腺上動(dòng)脈，結(jié)扎分支動(dòng)脈，并進(jìn)一步向遠(yuǎn)心端分離頸外動(dòng)脈；動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。 在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端結(jié)扎并切斷頸外動(dòng)脈，然后反折頸外動(dòng)脈，使其殘端與頸內(nèi)動(dòng)脈成一直線，由頸外動(dòng)脈殘端插入線栓/微管裝置(PE-0402 管)；頸外動(dòng)脈殘端系6-0 脈血液流出，栓/微管裝置，然后松開夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈的動(dòng)脈夾；沿頸內(nèi)動(dòng)脈推送絲線，小心避免線栓/微管裝置進(jìn)入翼腭動(dòng)脈；線栓插入距離頸總動(dòng)脈分叉處約17 ~19 mm，遇到阻力時(shí)停止插入；經(jīng)顱激光多普勒血流儀顯示血流值下降至基線值30%以下，MCAO 造模成功。 系緊環(huán)繞頸外的動(dòng)脈絲線，縫合頸前皮膚，75%乙醇擦洗傷口。

1.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 建模后24 h，由兩名不知分組情況的研究人員觀察大鼠的癥狀。 采用改良的Longa 神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分:0 分，無(wú)缺陷；1 分，對(duì)側(cè)前肢不能完全伸展；2 分，對(duì)側(cè)前肢不能伸出；3 分，輕微的向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4 分，嚴(yán)重的向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；5 分，向?qū)?cè)傾倒。

1.4 梗死體積測(cè)定 建模24 h 后，經(jīng)腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠。 將麻醉后的大鼠置于冰盤上，快速斷頭取腦，取出后立即放入冰箱中冷凍20 min。 然后切去嗅腦、額極、小腦和部分腦干。 用大鼠腦切片模具將剩余部分從前往后切成2 mm厚的腦片，共5 片。 將腦片移入裝有4% TTC染液的培養(yǎng)皿中，然后置于37℃恒溫箱避光染色20 min，每5 min 晃動(dòng)、翻面一次，保證腦片著色均勻。 染色結(jié)束后，將腦片放入PBS 溶液中洗滌，然后轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛溶液中固定24 h；腦片固定完畢后取出，數(shù)碼相機(jī)照相，使用Image J 圖像分析軟件計(jì)算梗死區(qū)域(染色減弱的大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域)面積。

梗死體積＝(梗死對(duì)側(cè)體積－梗死側(cè)非梗死區(qū)體積)/梗死對(duì)側(cè)體積×100%

1.5 組織病理學(xué)觀察 取大腦后，將海馬區(qū)組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成3 ~5 μm 厚的切片。 脫蠟復(fù)水后，用蘇木精、伊紅染色。 顯微鏡(OLYMPUS，Japan)下觀察組織病理學(xué)變化。

1.6 Western blot 使用BCA 蛋白分析試劑盒(Thermo Fisher Science，USA)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，上清液在蛋白SDS-PAGE 負(fù)載緩沖液中煮沸。 等量的蛋白質(zhì)樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離。 然后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜(Abcam，UK)上，含有10%脫脂奶粉的封閉液(Solarbio，China)封閉膜1.0 h，用Tris 緩沖鹽水加吐溫-20(Tween-20，T1082)清洗3 次后，添加相應(yīng)的一抗(S-100β、NSE、SREBP2、ADMA、DDAH1)，4℃下孵育過(guò)夜。 TBST 清洗膜3 次，與HRP 連接的二抗在室溫下孵育1.5 h，樣品用TBST 洗滌3 次后，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，Image J 軟件對(duì)靶蛋白進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。 以P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 MCAO 組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于Sham 組與HUK 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見圖1。

2.2 各組大鼠大腦梗死體積比較 與Sham 組比較，MCAO 組大鼠大腦可見多處梗死灶(呈白色)，未梗死部分呈紅色，而HUK 組大鼠梗死部分較MCAO 組明顯減少(圖2)。 體積測(cè)量發(fā)現(xiàn)，MCAO 組大鼠梗死體積為(40.25% ±2.14%)，高于HUK 組的(28.35% ±2.86%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

圖2 TTC 染色結(jié)果

2.3 各組大鼠大腦組織病理學(xué)改變結(jié)果 MCAO 組大鼠海馬神經(jīng)元表現(xiàn)為嚴(yán)重的損傷，核變形、細(xì)胞腫脹、排列分散，并有典型的細(xì)胞凋亡改變。 HUK組神經(jīng)元損傷明顯逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為海馬神經(jīng)元完整緊密排列，核仁清晰，染色均勻，細(xì)胞質(zhì)透明。 見圖3。

2.4 各組大鼠神經(jīng)損傷標(biāo)志物水平比較 MCAO 組大鼠大腦組織神經(jīng)損傷標(biāo)志物S-100β 和NSE 蛋白表達(dá)高于Sham 組與HUK 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見圖4。

圖3 HE 染色結(jié)果(a.Sham 組；b.MCAO 組；c.HUK 組；HE×200)

圖4 各組大鼠神經(jīng)損傷標(biāo)志物水平比較

2.5 HUK對(duì)MCAO大鼠SREBP2/ DDAH1/ ADMA信號(hào)通路影響 MCAO 組大鼠大腦組織ADMA 蛋白表達(dá)高于HUK 組與Sham 組，SREBP2、DDAH1蛋白表達(dá)低于HUK 組與Sham 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見圖5。

圖5 SREBP2、DDAH1、ADMA 蛋白檢測(cè)結(jié)果

3 討論

HUK 廣泛應(yīng)用于急性腦梗死的治療，其主要成分是從人體新鮮尿液中提取的238 個(gè)氨基酸的糖蛋白，可將激肽原轉(zhuǎn)化為激肽，有選擇地?cái)U(kuò)張大腦小動(dòng)脈，發(fā)揮血管擴(kuò)張劑的作用，同時(shí)可以促進(jìn)新血管的生成[9]。 然而，HUK 對(duì)急性腦梗死的保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。

ADMA 是內(nèi)源性一氧化氮合酶的抑制劑，可以減少一氧化氮的生成，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷[10]。 內(nèi)源性一氧化氮可以介導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方向，還可以舒張血管及支氣管平滑肌，改善通氣血流比例[11]。 ADMA 在多種組織和疾病中發(fā)揮重要作用，可導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，與高血壓、糖尿病、心力衰竭和肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生密切相關(guān)[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，MCAO 組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分增加，大腦梗死體積增加，大腦組織ADMA 表達(dá)顯著增加，而HUK 明顯降低了ADMA 表達(dá)，提示ADMA可能在腦梗死過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本研究中，MCAO 組大鼠DDAH1 蛋白表達(dá)降低，而HUK 可以明顯增加MCAO 大鼠DDAH1 蛋白表達(dá)。 DDAH1 是ADMA 的主要水解酶，可以將ADMA 分解為瓜氨酸和二甲胺經(jīng)腎排出[15]。DDAH1 與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、慢性心功能不全、高脂血癥、糖尿病及周圍動(dòng)脈閉塞性疾病有關(guān)[16-17]。 DDAH1 還可以通過(guò)激活Ras/PI3K/Akt通路，提高體內(nèi)一氧化氮水平[18]。 SREBP2 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的減少和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的丟失被激活，然后誘導(dǎo)觸發(fā)核轉(zhuǎn)位和膽固醇調(diào)節(jié)基因[19]。 有研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可以促進(jìn)SREBP2 蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)DDAH1 轉(zhuǎn)錄，降低 ADMA 表 達(dá)[20]。 這 提 示， HUK 可 能 通 過(guò)SREBP2/DDAH1/ADMA 信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)大鼠急性腦梗死的功能保護(hù)作用。

綜上所述，HUK 可明顯改善MCAO 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，減輕大腦梗死體積，緩解神經(jīng)元損傷，降低S-100β 和NSE 蛋白表達(dá)，對(duì)急性腦梗死發(fā)揮保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能通過(guò)調(diào)節(jié)SREBP2/DDAH1/ADMA 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。