坦不蘇病毒的研究進展

文│沈思思（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院）

坦不蘇病毒（TMUV）屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種單股正鏈RNA蟲媒病毒，1955年首次在馬來西亞吉隆坡被發(fā)現(xiàn)并分離出來。但它與人類或動物健康的相關性尚未完全揭示。黃病毒屬有許多成員，包括登革熱病毒（DENV）、黃熱病病毒（YFV）、日本腦炎病毒（JEV）和寨卡病毒都是人畜共患病和重要的媒介傳播病毒，每年導致數(shù)百萬人感染，從輕微發(fā)熱癥狀到出血性或神經(jīng)疾病。在自然界中，鳥類通常是許多黃病毒的擴增宿主和貯存宿主。2010年4月，在中國鴨TMUV首次被確定為鴨產(chǎn)蛋下降綜合征的病原體，該病的特點是產(chǎn)蛋量大幅下降，受感染的產(chǎn)蛋鴨和種鴨的采食量突然下降，還出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀、卵巢出血、卵泡閉鎖和淋巴細胞浸潤等主要病理變化。感染率和發(fā)病率很高，總死亡率為5%～15%。禽TMUV已在家禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，由于黃病毒的人畜共患病特性，禽TMUV可能會引起公共衛(wèi)生問題。因此，筆者總結了禽TMUV病毒基因組特征、宿主范圍、流行病學和系統(tǒng)發(fā)育、臨床癥狀、檢測方法以及治療的研究進展，以期為后續(xù)研究提供參考。

一、基因組特征

坦不蘇病毒是單股正鏈RNA病毒，基因組長度約為11kb，有一個開放閱讀框，兩側是5′端和3′端非編碼區(qū)（UTR）。5′端有m7GPPaMP結構，3′端沒有poly A尾。通過病毒和細胞蛋白酶的后續(xù)切割，多聚蛋白被加工成基因組5′端的3種結構蛋白：衣殼（C）蛋白、前膜（PrM）蛋白和包膜（E）蛋白；7種非結構（NS）蛋白編碼：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。結構蛋白形成病毒顆粒并參與病毒與宿主細胞的融合，在病毒受體結合、進入和融合中發(fā)揮重要作用，而NS蛋白參與病毒RNA復制、病毒粒子組裝和先天免疫逃避反應。

二、宿主范圍

TMUV宿主范圍廣泛，包括蚊子、雞、鴨、鵝、鴿子和麻雀等。產(chǎn)蛋下降綜合征影響了肉鴨、蛋鴨及多種品種鴨，包括北京鴨、紹興鴨、龍巖鴨、番鴨和家養(yǎng)野鴨等。體外實驗室研究表明，鴨TMUV在廣泛的哺乳動物細胞系（即Vero、BHK21、HeLa、HepG2和SH-SY5Y）、禽源細胞系（即DEF、GEF和DF-1）和蚊媒細胞系（即C6/36和白紋伊蚊）中復制良好。此外，一項人工感染研究發(fā)現(xiàn)，BALB/c小鼠和昆明小鼠在腦內(nèi)接種后對鴨TMUV敏感，但對皮下或鼻腔接種不敏感，病理變化與許多其他腦炎性黃病毒的典型特征相似，嚴重可導致死亡。該病毒在大腦和脾中大量復制。此外，一項針對鴨業(yè)工人的調(diào)查報告顯示，70%以上的受試血清樣本中檢測到鴨TMUV抗體，其中約50%的口腔拭子樣本對TMUV RNA呈陽性，表明其可能從鴨傳播到人或從鴨傳播到其他非禽宿主上。隨后的體內(nèi)研究表明，鴨TMUV不能在皮下接種的恒河猴上引起病毒血癥或臨床癥狀，但可以通過感染誘導引起鴨TMUV特異性體液免疫反應。這些數(shù)據(jù)表明，鴨TMUV在體內(nèi)和體外的多種非禽類細胞中復制良好，但鴨TMUV引起人類疾病的風險沒有其他黃病毒高。

三、流行病學和系統(tǒng)發(fā)育

2010年TMUV首次在中國東南部鴨子中被確診為未知原因引起的鴨產(chǎn)蛋下降綜合征，同年，該病迅速蔓延到中國大部分養(yǎng)鴨地區(qū)，包括許多沿海省份和周邊地區(qū)及北京市、河北省、山東省、江蘇省、安徽省、浙江省、江西省和福建省等。隨后，中國西南部和南部報告的病例數(shù)量不斷增加，包括2012年的廣東省和廣西壯族自治區(qū)、2013年的重慶市和2015年的上海市。TMUV感染鴨的臨床癥狀包括精神沉郁、生長遲緩、食欲減退，甚至癱瘓或死亡。被感染的產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋數(shù)量嚴重減少（產(chǎn)蛋量減少20%～60%，偶爾高達90%），病理剖檢觀察到嚴重的卵巢出血、卵巢炎和卵巢退化。此外，分子系統(tǒng)發(fā)育分析將中國分離的所有TMUV歸為一枝。

馬來西亞該分離株更接近所有中國TMUV菌株。但蚊媒傳播的TMUV并沒有被證明是人類和動物疾病的病原體。直到2012年，在馬來西亞的幾個養(yǎng)鴨場，4～7周齡的肉雞鴨群中出現(xiàn)了幾次以共濟失調(diào)、跛足和進行性癱瘓為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在進行大體病理學和組織學觀察、病毒分離、雛鴨繁殖和基因組測序后，確認該病的病原為馬來西亞鴨坦不蘇病毒，其基因組RNA序列與中國的相關鴨TMUV相似。

2002年，一項研究報告顯示，在泰國同一地區(qū)的庫蚊和哨兵鴨中檢測到TMUV。但直到2013年才有關于TMUV在鳥類中感染的疾病報告，當時泰國養(yǎng)鴨場新出現(xiàn)了一種嚴重的減蛋綜合征傳染病。這種疾病迅速蔓延，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。最終被確診為鴨TMUV。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，泰國的TMUV與馬來西亞的傳統(tǒng)鴨TMUV和中國新分離的鴨TMUV相同。

四、臨床癥狀

TMUV是一種由蚊媒傳播的病毒性黃病毒，與WNV和Usutu病毒（USUV）一樣，其自然維持周期涉及鳥類和蚊子。鳥類感染的病因以流涕、腹瀉、厭食和社會行為紊亂等突發(fā)性急性癥狀為特征。受感染的動物還表現(xiàn)出嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括腦炎、行動困難、共濟失調(diào)和癱瘓。養(yǎng)殖場感染率可達到90%，具體取決于飼養(yǎng)條件，死亡率5%～30%不等，并可能因繼發(fā)感染而增加。脾、肝、腎和大腦通常出現(xiàn)肉眼可見的病變。組織學分析顯示，感染器官出現(xiàn)了多種微觀變化，包括出血、炎癥、增生、巨噬細胞和淋巴細胞浸潤等。在種鴨常見臨床表現(xiàn)為卵巢受損，伴有大量炎癥、出血和充血，并伴有器官退化。TMUV感染可導致胚胎退化和排卵量急劇下降，這被稱為產(chǎn)蛋下降綜合征，造成養(yǎng)鴨業(yè)的重大經(jīng)濟損失。最近的一項研究報告稱，所有年齡段的鴨子都可能感染TMUV。盡管在一些鴨群中，幼齡動物的感染程度更嚴重，但在老種鴨中易感性更高。此外，老齡的被感染鴨病毒脫落期較長，載量較高，沒有臨床癥狀，是隱性攜帶者，表明這些動物在疫情暴發(fā)期間發(fā)揮了重要作用。

目前已經(jīng)證實TMUV是一種鳥類嗜神經(jīng)病毒，盡管在神經(jīng)元水平上的擴散機制仍知之甚少。最近一項關于雛鴨模型的研究揭示了血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的方式。早期幾乎沒有臨床癥狀，盡管病毒在大腦中復制并由此誘導炎性細胞因子，但血腦屏障似乎不易被病毒滲透。因此，有必要等到感染晚期才能看到與血腦屏障破壞和微血管內(nèi)皮細胞擴散相關的神經(jīng)癥狀，導致感染動物的炎癥和致命性腦炎。

雖然TMUV感染禽類的癥狀得到廣泛描述，但很少感染其他脊椎動物宿主。2020年，Yurayart等報告，TMUV感染小鼠腦內(nèi)的神經(jīng)發(fā)病機制和全球傳播。這些動物表現(xiàn)出廣泛的臨床癥狀，導致死亡的嚴重內(nèi)部器官損傷。Tang等調(diào)查了禽類養(yǎng)殖場工人中TMUV感染情況，收集口腔拭子和血清樣本進行TMUV分子檢測和血清學篩查。分子方法為半巢式RT-PCR，而血清學檢測方法為IgG ELISA和病毒中和試驗。超過70%的血清樣本為陽性，TMUV可以從48%的口腔拭子中分離出來。感染工人也表現(xiàn)出無癥狀。TMUV對人類有潛在的傳播風險，建議將TMUV視為一種新出現(xiàn)的人畜共患病病原體，盡管與其他禽類黃病毒成員一樣，人類傳播事件沒有進一步的人傳人現(xiàn)象。泰國最近的一項研究報告也稱，人類對TMUV血清呈陽性，并且沒有臨床癥狀。這項研究強調(diào)了對人類，特別是接觸禽類動物的高風險人群進行前瞻性監(jiān)測和調(diào)查的重要性。還需進一步的研究來更好地評估哺乳動物的潛在結果，尤其是神經(jīng)表現(xiàn)及其在傳播中的作用。

五、檢測方法

自從首次分離出TMUV以來，已經(jīng)開發(fā)了幾種檢測技術用來診斷該病毒。診斷工具的開發(fā)是為了防止養(yǎng)殖場大規(guī)模疫情暴發(fā)，保護家禽業(yè)免受經(jīng)濟損失。在生產(chǎn)和出口大量家禽的國家預防疫情暴發(fā)是一個重大問題，尤其是對我國來說，因為我國是世界上第一大鴨子生產(chǎn)國。

Kono等通過電子顯微鏡觀察到在感染TMUV的轉化雞B淋巴細胞系BK3（LSCC-BK3）中的病毒顆粒。雖然病毒分離和電子顯微鏡仍然是最佳診斷方法，但它們不適合用于診斷目的。電子顯微鏡的觀察非常耗時，需要配備一臺昂貴的設備和訓練有素的高技能人員及專用實驗室，這使得無法在實驗室之外進行檢測。此外，必須使用新鮮標本來獲得活病毒。

目前，常見的TMUV診斷方法包括基于NS1蛋白檢測的酶聯(lián)免疫吸附試驗血清學檢測和中和試驗。E蛋白的空間結構在DENV、WNV和JEV中得到很好的描述，顯示了黃病毒之間的高度相似性，由于這種糖蛋白暴露在病毒粒子表面，具有免疫原性。事實上，E蛋白已被廣泛用于生產(chǎn)單克隆或多克隆抗體。最近有報道稱，一種新的中和抗體（1G2）與JEV、WNV和ZIKV交叉反應，靶向位于E蛋白結構域II中的一個最小表位，在小鼠中對TMUV有很大的保護作用，表明其在檢測中的潛在用途，以及在診斷和治療中的一個有價值的候選者。逆轉錄酶結合聚合酶鏈式反應（RTPCR）通常用于檢測病毒的存在，目前，開發(fā)了幾種針對幾種禽病毒的多重PCR方法。最后，開發(fā)了一種新的檢測方法，使用逆轉錄酶PCR結合質譜檢測來篩查特定鴨病毒的存在。利用這項技術可以同時以較低的檢測閾值識別養(yǎng)鴨業(yè)中的各種病毒感染。

為確保其傳播，TMUV必須先在蚊媒載體中復制。在胚胎雞蛋中分離病毒的同時，C6/36蚊媒細胞系被用于病毒分離。但由于缺乏脊椎動物宿主中病毒的信息，導致使用原代細胞和細胞系來研究病毒的生物學特性。不同類型的禽類細胞已被用于研究TMUV的生物學特性，包括BK3細胞、轉化的雞B淋巴細胞細胞系、雞巨噬細胞衍生細胞系HD-11和雞胚成纖維細胞分離的DF1細胞系。除了用于特定用途外，雞胚成纖維細胞、鴨蛋和雞蛋通常用于病毒分離和維持。

TMUV還能在廣泛的非禽類細胞中復制，用于研究TMUV對哺乳動物宿主的影響。人類細胞系被用來評估病毒的趨向性，并確定TMUV感染的分子機制。HEK293T細胞系和小鼠原代細胞系（MEF）用于研究先天性免疫反應及TMUV的免疫逃避反應。最近使用各種人類細胞系對TMUV細胞取向性進行研究，肝、腎和神經(jīng)細胞系在不同程度上存在易感性，而肺、肌肉、B細胞、T細胞和單核細胞對感染有很大抵抗力。所有研究表明，TMUV能在廣泛的脊椎動物細胞中復制，哺乳動物和鳥類的靶器官相似。但關于人類細胞發(fā)病機制的研究還不多，還需要進一步探索。此外，雖然TMUV通過蚊媒叮咬傳播，但還需要更多蚊媒生物學信息，并對C6/36細胞進行體外研究。

六、治療

與其他一些黃病毒感染一樣，TMUV沒有特定的治療方法。目前正在評估不同分子的抗病毒效果。如四環(huán)素類在體外對嗜神經(jīng)病毒感染的神經(jīng)細胞死亡有一定效果。在感染TMUV的鴨神經(jīng)細胞中也發(fā)現(xiàn)了這種神經(jīng)保護作用。EGCG是一種多酚類活性分子，已經(jīng)顯示出對不同病毒的廣譜活性，并且似乎是一種很有希望治療TMUV感染的藥物。在BHK-21細胞中使用EGCG，結果顯示TMUV復制顯著減少，可能是由于I型干擾素產(chǎn)量增加。經(jīng)EGCG處理的TMUV感染雛鴨的存活率增加證實了這種效果。新的治療策略正在研究并用于預防或治療TMUV。衣殼靶向病毒滅活（CTVI）方法是一種針對衣殼蛋白的抗病毒策略，最初開發(fā)用于靶向逆轉錄病毒，并在DENV和JEV的治療中取得了成功，最近也被研究用于TMUV的治療。

七、結語

與其蟲媒病毒一樣，TMUV利用近年來有利的條件，在亞洲各地傳播。2010年，中國首次暴發(fā)這種病毒，導致人們重新考慮這種病毒的危險性。其傳播在很大程度上是由養(yǎng)殖場密集飼養(yǎng)家禽造成的。在這種情況下，TMUV甚至在沒有蚊子媒介干預的情況下在動物之間傳播。最后，鳥類的影響尚未得到明確證明，但TMUV在亞洲傳播中發(fā)揮重要作用。因此，密集的養(yǎng)殖業(yè)、日益增長的貿(mào)易和環(huán)境變化促進了TMUV的廣泛傳播。這種情況更令人擔憂，因為這種病毒有傳播到人類的風險。因此，可能會導致一種新的人畜共患病。由于缺乏廣泛的監(jiān)測，迄今為止，該病毒只在3個亞洲國家被檢測到，并且只在中國和泰國進行積極研究。但這些國家和病毒的系統(tǒng)發(fā)育模式表明，該病毒在亞洲和太平洋地區(qū)廣泛存在。近年來，關于宿主-病原體相互作用的研究主要集中在禽類模型上，但也應更好地了解哺乳動物，尤其是該病毒的生物學特性及對人的影響。