搭載淫羊藿苷聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA-ICA)復(fù)合支架對兔軟骨細(xì)胞的影響

張繽月，聶新宇，于海馳，袁天陽，于 同，張 郡*

(1.吉林省一汽總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長春130011；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 骨科，吉林 長春130014)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是以軟骨退化、骨質(zhì)硬化和關(guān)節(jié)內(nèi)持續(xù)的低度炎癥為特征的，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的關(guān)節(jié)退行性疾病，給患者、家庭和社會造成了沉重的負(fù)擔(dān)。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明全球已有超過3億OA患者。目前，我國40歲以上人群原發(fā)性O(shè)A的總體患病率已高達(dá)46.3%，并且隨著我國人口老齡化程度的不斷加劇，OA 的患病率有逐漸上升的趨勢[1]。OA目前的治療方式主要圍繞改善患者癥狀，例如降低疼痛、改善膝關(guān)節(jié)功能等，尚沒有有效的干預(yù)措施能夠影響其關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，改善OA進(jìn)展[2]。中醫(yī)認(rèn)為，骨骼和腎臟之間有很強(qiáng)的聯(lián)系，作為有效的溫腎類中藥淫羊藿苷能夠通過滋補(bǔ)腎臟來改善骨骼健康,在中國、日本和韓國已經(jīng)被廣泛用于治療骨性關(guān)節(jié)炎[3-4]。淫羊藿苷(Icariside，ICA)，是一類黃酮提取物，是從中國傳統(tǒng)草藥淫羊藿中提取.它具有多種生物學(xué)和藥理學(xué)特性，它能夠通過MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路和b-catenin信號通路刺激成骨分化和骨形成[5-8]。先前的研究表明ICA可以抑制一氧化氮和基質(zhì)金屬蛋白酶(ΜMPs)的合成，減少細(xì)胞外基質(zhì)的破壞[9-10]。Ma等發(fā)現(xiàn)ICA可以減輕缺氧誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡[11]。然而，軟骨細(xì)胞退變是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的重要因素之一，其與ICA的相關(guān)研究較少。因此，探究ICA與兔軟骨細(xì)胞的關(guān)系具有一定的潛在臨床意義。聚 乳 酸 - 羥 基 乙 酸 共 聚 物(Poly Lactic-Co-Glycolic Acid，PLGA)是一種具有優(yōu)秀的可降解性并且具有良好生物相容性的生物材料[12]。先前的研究表明，負(fù)載ICA的生物材料可能具有軟骨組織工程的潛力[13]。因此，本研究擬應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)制造PLGA支架，并且將ICA引入到支架當(dāng)中制備PLGA-ICA復(fù)合支架。通過研究此種復(fù)合支架對兔軟骨細(xì)胞的影響來評估此種復(fù)合支架的生物相容性治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在作用。本研究通過探討PLGA-ICA復(fù)合對兔軟骨細(xì)胞的影響，闡明其是否具有維持關(guān)節(jié)軟骨的功能形態(tài)和軟骨下骨的功能的可能性，從而阻止OA的進(jìn)展，為骨關(guān)節(jié)炎的臨床治療提供潛在的治療手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

PLGA(聚乳酸/羥基乙酸=75/25,相對分子質(zhì)量為40000，中國長春圣博瑪生物材料有限公司)、ICA(成都瑞芬思生物技術(shù)公司)、Ⅱ型膠原抗體(美國Abcam 公司)、胎牛血清(美國Gbico公司)、細(xì)胞培養(yǎng)用雙抗(中國索萊寶生物技術(shù)公司)、DMEM培養(yǎng)基(美國Gbico公司)、MTT試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、熒光顯微鏡(德國萊卡公司)、掃描電鏡(SEM，日本奧林巴斯公司)、測角儀(德國KRUSS公司)、Tecan Infinite F200酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)、CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Eppendorf公司)、普通臺式離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.2 PLGA-ICA復(fù)合支架的制備

采用靜電紡絲法制備了PLGA-ICA復(fù)合支架。將PLGA溶于六氟異丙醇中，制成10%的PLGA溶液，并分別添加0.01%、0.1%和1%(W/W)濃度的ICA。然后將混合溶液加載到靜電紡絲裝置中，外加電壓為10 kV。針尖到集流板的距離為15 cm。流速為0.3 mL·h-1。隨后，于室溫下真空干燥過夜后得到復(fù)合支架。最后，用紫外光對制成的紡絲進(jìn)行殺菌處理，以供進(jìn)一步使用。

1.3 PLGA-ICA復(fù)合支架的理化性能

使用掃描電鏡觀察PLGA-ICA復(fù)合支架的表面形貌。使用Image-Pro Plus(版本6.0.0.260，Media Controbernetics，MD)對纖維直徑進(jìn)行量化。使用接觸角測試儀過靜態(tài)水接觸角來評價(jià)支架的表面濕度，其測量方法是通過計(jì)算水滴與支架水平面之間的夾角來測量的。

1.4 PLGA-ICA復(fù)合支架的生物相容性

1.4.1兔軟骨細(xì)胞的制備、培養(yǎng)與分組 兔軟骨細(xì)胞取自新西蘭大白兔關(guān)節(jié)軟骨(中國長春生物制品研究所股份有限公司)。細(xì)胞在含10%胎牛血清(V/V)、100 U·mL-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，種植于24孔板中，細(xì)胞數(shù)量為2.5×104 ml-1，置于5%CO2、37℃孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基每隔2 d更換一次。當(dāng)其達(dá)到80%融合時(shí)，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)評估。

1.4.2MTT法檢測對各組兔軟骨細(xì)胞增殖活性

細(xì)胞分為8組：空白對照組、PLGA組、0.01%ICA組、0.1%ICA組、1%ICA組、0.01%ICA+PLGA組、0.1%ICA+ PLGA組、1%ICA+PLGA組?？瞻讓φ战M在24孔板中加入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，PLGA組和ICA組每孔加入1 cm2含不同濃度ICA的PLGA電紡絲。ICA組每孔加入等量ICA。由于ICA在水中的溶解性，1%ICA組的ICA濃度實(shí)際為0.3%。3 d后，每孔加入100 ml MTT液(于PBS溶液中濃度為5 g·L-1)，室溫孵育4 h。使用Tecan Infinite F200酶標(biāo)儀在492 nm處測量吸光度(A)值。

1.4.3兔軟骨細(xì)胞細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫熒光檢測

通過不同干預(yù)措施(PLGA、PLGA負(fù)載不同濃度的ICA)培養(yǎng)24 h后，觀察兔軟骨細(xì)胞的Ⅱ型膠原免疫熒光。取出培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次。細(xì)胞用4.0%多聚甲醛固定12 min，用PBS緩沖液沖洗3次，進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫熒光檢測，在37℃下染色10 min，用熒光顯微鏡觀察貼壁細(xì)胞的圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PLGA-ICA復(fù)合支架的表征

利用掃描電鏡對PLGA-ICA復(fù)合支架表面形貌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究，見圖1。PLGA纖維支架的平均直徑為1.58 μm±0.16 μm。加入不同濃度的ICA后，纖維表面形貌變得粗糙。復(fù)合纖維支架的平均直徑分別為1.61 μm±0.59 μm、1.75 μm±0.32 μm和1.89 μm±0.43 μm,各組纖維直徑比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用接觸角測試儀檢測可得純PLGA組的水接觸角為88.32°±4.57°，隨著ICA的濃度增加，其接觸角從82.58°±8.03°降低到71.25°±0.51°，與PLGA組比較比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖 2，3。

圖1 掃描電鏡下PLGA-ICA復(fù)合支架超微結(jié)構(gòu)圖

圖2 PLGA-ICA復(fù)合支架的水接觸角

圖3 PLGA-ICA復(fù)合支架的水接觸角變化

2.2 各組兔軟骨細(xì)胞增殖活性

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對照組比較，隨著ICA的濃度上升，細(xì)胞增殖的效果差異顯著(P<0.05)，表明ICA能夠促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞的增殖，并且隨著濃度的上升，對兔軟骨細(xì)胞的增殖能力先上升然后逐漸下降，見表1。與空白PLGA支架組相比，搭載了ICA的PLGA復(fù)合支架組同樣能夠促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞的增殖，細(xì)胞增殖趨勢與無支架保持一致，與PLGA組比較，載藥組有顯著性的差異(P<0.05)，見表2。

表1 ICA對兔軟骨細(xì)胞增殖活性影響

表2 PLGA/ICA對兔軟骨細(xì)胞增殖活性影響

2.3 Ⅱ型膠原免疫熒光觀察細(xì)胞黏附

通過對兔軟骨細(xì)胞進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫熒光檢測，觀察細(xì)胞黏附。經(jīng)培養(yǎng)24 h后，通過熒光顯微鏡觀察可見，與未進(jìn)行任何處理的空白PLGA支架組相比，搭載了ICA的復(fù)合支架的兔軟骨細(xì)胞黏附數(shù)量明顯增加，并隨著ICA濃度增加，細(xì)胞黏附成呈先增多后較少。PLGA-ICA復(fù)合支架中培養(yǎng)的細(xì)胞其擴(kuò)散區(qū)域比單純PLGA支架的細(xì)胞擴(kuò)散區(qū)域要寬，見圖4。

圖4 兔軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫熒光檢測

3 討論

目前用藥物或手術(shù)治療OA，都沒有取得令人滿意的療效[1]。已有的研究表明軟骨細(xì)胞凋亡在OA患者中明顯增加，細(xì)胞存活率明顯下降[14]。因此，找到抑制軟骨細(xì)胞凋亡或者增加細(xì)胞存活率的方法，從而更有效地治療OA是很有意義的。ICA是淫羊藿苷中提取的化合物，對骨與關(guān)節(jié)損傷有一定的修復(fù)作用[15]，但其具體機(jī)制尚未明確。本研究通過構(gòu)建不同濃度的PLGA-ICA復(fù)合支架，與兔軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，對上述問題開展具體研究。

靜電紡絲技術(shù)制備的復(fù)合材料具有良好的生物相容性，是作為修復(fù)機(jī)體生物活性物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)載體，有研究顯示：靜電紡絲表面的粗糙結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的黏附生長，發(fā)揮生物學(xué)功能[16]。與外周給藥方式相比，PLGA-IGA復(fù)合支架通可以精準(zhǔn)控制藥物濃度，控制藥物作用部位，精準(zhǔn)化、靶向化避免了全身用藥帶來的機(jī)體毒副作用。

本研究結(jié)果表明，應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)制造的搭載ICA的PLGA復(fù)合支架可以提高其親水性。與單純的PLGA支架相比，復(fù)合支架對于兔軟骨細(xì)胞的增殖及粘附具有良好的促進(jìn)作用，表現(xiàn)出了良好的生物相容性。這些數(shù)據(jù)表明聯(lián)合了ICA的復(fù)合PLGA支架在治療骨關(guān)節(jié)炎方面具有一定的潛力。

在本研究中，通過掃描電鏡顯示，在低濃度ICA下，纖維平均直徑的變化趨勢無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但隨著藥物濃度的增加，其表明標(biāo)的更為粗糙。對于支架而言，纖維的直徑會隨著制造參數(shù)的變化呈現(xiàn)出不同的結(jié)果，例如孔板直徑、溶液濃度和單位長度電壓等。當(dāng)溶液濃度較低時(shí)，表面張力的影響大于粘彈性力，纖維直徑呈現(xiàn)出不穩(wěn)定或者相對粗糙的狀態(tài)[17-18]。結(jié)果表明，當(dāng)加入0.1%的ICA時(shí)，對于溶液的濃度影響不大。水接觸角的結(jié)果分析表明，ICA的加入可以改善支架的親水性。由于支架的親水性在與細(xì)胞的相互作用中起著至關(guān)重要的作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞的粘附以及增殖。因此本研究的結(jié)果表明，復(fù)合支架可以為細(xì)胞提供適合其生長的微環(huán)境，能夠促進(jìn)細(xì)胞的粘附及增殖。

本研究中ICA溶液培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)ICA的劑量依賴性，在ICA的濃度約為0.3%時(shí)，其吸光度下降，這可能是由于ICA的劑量過大后其細(xì)胞毒性對細(xì)胞的損害所致。同時(shí)在搭載了ICA的PLGA復(fù)合支架上進(jìn)行兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，任何濃度的ICA復(fù)合支架均能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，各組間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能是由于ICA的釋放緩慢并且穩(wěn)定的緣故，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基中ICA的濃度相對穩(wěn)定。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)的免疫熒光結(jié)果與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。上述實(shí)驗(yàn)再次表明搭載了ICA的復(fù)合支架具有良好的生物相容性。曾有研究表明，應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)制備的支架可以加速兔軟骨細(xì)胞的增殖，同時(shí)維持兔軟骨細(xì)胞的表型[19-20]。PLGA-ICA的復(fù)合支架比單純的PLGA支架具有更好的促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。