玉米耐旱相關(guān)性狀Meta-QTL及候選基因表達(dá)分析

郭長(zhǎng)順， 李曉輝， 張春宵， 崔海燕， 金峰學(xué)*， 具紅光

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133200；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 玉米研究所，吉林 公主嶺 130033；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 玉米研究所，濟(jì)南 250100)

在所有影響玉米生產(chǎn)的非生物脅迫中，干旱是最為嚴(yán)重且最具破壞性的因素之一。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，可以對(duì)干旱脅迫下的玉米產(chǎn)量和農(nóng)藝-生理性狀的 QTL進(jìn)行遺傳剖析, 為分子標(biāo)記輔助改良奠定了基礎(chǔ)。迄今為止，前人定位了大量玉米耐旱相關(guān)QTL[1-20]，然而，這些研究結(jié)果采用的遺傳群體材料、分子標(biāo)記類型以及統(tǒng)計(jì)方法大不相同，造成遺傳圖譜差異較大，定位到的QTL置信區(qū)間過(guò)大等問(wèn)題，無(wú)法保證QTL的真實(shí)性。

元分析作為一種新興的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法可以對(duì)不同研究數(shù)據(jù)進(jìn)行再次統(tǒng)計(jì)和分析，且可以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行全面檢驗(yàn)[21]。采用元分析方法，在整合不同研究背景QTL的基礎(chǔ)上，建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化QTL置信區(qū)間，提高QTL準(zhǔn)確性和有效性。粟文娟等[22]收集了360個(gè)玉米耐旱相關(guān)QTL，采用元分析和overview方法獲得了79個(gè)Meta-QTL，并在43個(gè)MQTL區(qū)間內(nèi)檢測(cè)到抗旱相關(guān)基因。Chen等[23]收集了999個(gè)玉米產(chǎn)量性狀相關(guān)QTL信息，獲得了76個(gè)MQTL區(qū)域。Zhao等[24]收集玉米株高、ASI等7中農(nóng)藝性狀共637個(gè)玉米耐旱相關(guān)QTL信息，篩選出36個(gè)MQTL，并在MQTL區(qū)間內(nèi)預(yù)測(cè)了39個(gè)候選基因。

該研究收集整理了正常水分條件下玉米耐旱相關(guān)QTL信息，利用Biomercator 4.2軟件將不同作圖群體的QTL映射到IBM2 2008 Neighbors遺傳圖譜上，通過(guò)元分析方法獲得玉米耐旱相關(guān)Meta-QTL，結(jié)合生物信息學(xué)方法，在玉米B73基因數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找與水稻同源的玉米耐旱候選基因，為挖掘玉米耐旱候選基因和進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 玉米耐旱相關(guān)QTL信息收集

通過(guò)MaizeGDB、中國(guó)知網(wǎng)、NCBI等網(wǎng)站收集和整理了20篇文獻(xiàn)發(fā)表的在正常水分條件下定位到的玉米耐旱相關(guān)性狀QTL信息，包括QTL名稱、QTL性狀、染色體位置、LOD值、貢獻(xiàn)率、置信區(qū)間、群體類型、作圖群體大小以及遺傳圖譜等。

1.2 玉米耐旱相關(guān)QTL信息整合

在QTL定位試驗(yàn)中，QTL的置信區(qū)間和表型貢獻(xiàn)率(R2)為2個(gè)重要參數(shù)。當(dāng)某個(gè)QTL的置信區(qū)間未給出時(shí)，可以根據(jù)Darvasi和Soller[25]的公式推斷出其95%的置信區(qū)間。

C.I.= 530/ (N×R2);

(1)

C.I.= 163/ (N×R2);

(2)

式中,CI(confidence interval)指QTL置信區(qū)間，N代表作圖群體，R2代表該QTL表型貢獻(xiàn)率。公式(1)適用于F2作圖群體和回交作圖群體，公式(2)適用于重組自交系作圖群體。

應(yīng)用Biomercator 4.2軟件對(duì)收集的玉米耐旱相關(guān)性狀QTL進(jìn)行映射，利用齊序函數(shù)計(jì)算共有標(biāo)記區(qū)間，將原始QTL置信區(qū)間的兩端分子標(biāo)記和QTL的最佳位置按比例標(biāo)注在IBM 2 2008 Neighbors參考圖譜上[26]。為提高映射的準(zhǔn)確性，舍棄存在爭(zhēng)議的標(biāo)記和不能映射在參考圖譜QTL的信息。

1.3 玉米耐旱相關(guān)QTL的元分析

利用Biomercator 4.2軟件中的Meta-analysis程序?qū)φ虾蟮腎BM2 2008 Neighbor遺傳圖譜進(jìn)行元分析。將同一染色體同一位點(diǎn)附近多個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)QTL計(jì)算出1個(gè)一致性QTL，其過(guò)程包括1-、2-、3-、4-、N-QTL等5個(gè)模型，并按照最大似然函數(shù)比，通過(guò)高斯定理給出 QTL 在染色體上最可能排列的位置和置信區(qū)間，其中，AIC最小值給出的模型為最優(yōu)QTL模型，即Meta-QTL[27]。篩選條件為原始QTL的LOD值≥3、R2值≥5。

1.4 基于基因比較定位的玉米耐旱候選基因挖掘

從Gramene網(wǎng)站(https://www.gramene.org/)收集克隆的水稻耐旱基因，在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載基因核苷酸序列，并利用NCBI在線軟件Blastn比較水稻耐旱基因核苷酸序列與玉米B73基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中核苷酸序列的同源性。對(duì)比條件為E-value值小于1E-20，核苷酸序列匹配度大于80%確定同源。挖掘與水稻耐旱相關(guān)基因同源的玉米耐旱候選基因。

1.5 玉米耐旱候選基因在不同組織中的表達(dá)模式

利用NCBI網(wǎng)站的GEO Data Sets功能查詢GSE71723轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù)，下載該研究找到的玉米耐旱候選基因在根、莖、葉、穗4個(gè)不同組織的水分條件下和干旱脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。利用imageGP網(wǎng)站(www.bioinformatics.com.cn)對(duì)玉米耐旱候選基因的組織表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換和可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米抗旱相關(guān)QTL信息的收集與映射

共收集國(guó)內(nèi)外發(fā)表的20篇玉米耐旱相關(guān)QTL定位文章，涉及17個(gè)作圖群體。耐旱相關(guān)15個(gè)性狀，分別為株高、穗位高、根長(zhǎng)、根重、根數(shù)、散粉期、吐絲期、ASI、穗長(zhǎng)、穗粗、穗行數(shù)、行粒數(shù)、百粒重、結(jié)實(shí)率、產(chǎn)量，映射在IBM2 2008 Neighbors圖譜的211個(gè)QTL在10條染色體上呈不均勻分布，其中，第2和第4兩條染色體QTL數(shù)目最多，第5和第8條染色體QTL數(shù)目最少(圖1)。玉米耐旱相關(guān)QTL中共有68.24%QTL表現(xiàn)為R2≤10%，說(shuō)明玉米耐旱性為多個(gè)微效基因所控制(圖2)。

圖1 QTL在染色體上的分布情況 圖2 實(shí)驗(yàn)所包含的性狀中由單個(gè)QTL解釋的方差

2.2 玉米耐旱相關(guān)性狀QTL元分析

利用Biomercator 4.2軟件中的元分析程序?qū)τ成涞絀BM2 2008 Neighbors參考圖譜上的211個(gè)QTL進(jìn)行元分析，得到39個(gè)MQTL，共包含了3 348個(gè)基因(表1)。39個(gè)MQTL在玉米10條染色體上均有分布，依次為6、5、2、2、3、5、4、3、5和4個(gè)(圖3)，其置信區(qū)間均有不同程度縮小(表1)，如1號(hào)染色體MQTL2由7個(gè)QTL整合得到，原平均圖距17.21 cM，整合后MQTL區(qū)間為8.5 cM；4號(hào)染色體MQTL14由7個(gè)QTL整合得到，原平均圖距為21.26 cM，整合后MQTL圖距為4 cM。此外，還發(fā)現(xiàn)與多個(gè)耐旱性狀相關(guān)的MQTL，例如1號(hào)染色體MQTL4與根長(zhǎng)、百粒重相關(guān)；4號(hào)染色體MQTL15與莖粗、單株穗數(shù)、穗位高、散粉期相關(guān)；上述MQTL區(qū)段可能存在控制玉米耐旱性狀的“一因多效”QTL。

表1 正常條件下MQTL相關(guān)信息

續(xù)表1 正常條件下MQTL相關(guān)信息

圖3 MQTL在染色體上的位置

2.3 基于基因比較定位的玉米耐旱候選基因挖掘

為了鑒定與MQTL區(qū)域耐旱相關(guān)的候選基因，從Gramene網(wǎng)站(https://www.gramene.org/)收集了9個(gè)功能特征與耐旱相關(guān)的水稻基因，利用NCBI網(wǎng)站在線軟件Blastn比較水稻耐旱基因核苷酸序列與玉米B73基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中核苷酸序列的同源性。經(jīng)同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)水稻耐旱基因(OsSKIPa、ZFP185、OsMFT1)同源的玉米候選基因未在MQTL區(qū)域，其余6個(gè)同源的玉米候選基因均在MQTL區(qū)域內(nèi)，分別位于MQTL7、MQTL21、MQTL22、MQTL27、MQTL32和MQTL36區(qū)間內(nèi)(表2)。

表2 玉米耐旱候選基因

2.4 玉米耐旱候選基因在不同組織中的表達(dá)模式

為探究耐旱候選基因在玉米中的組織特異性表達(dá)模式，對(duì)6個(gè)玉米耐旱候選基因正常水分條件下和干旱處理?xiàng)l件下的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究了玉米根、莖、葉和穗4個(gè)不同組織的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)6個(gè)玉米耐旱候選基因在不同組織或器官中的表達(dá)模式有明顯差異。受干旱脅迫誘導(dǎo)，Zm00001d037112在根、莖、穗中上調(diào)表達(dá)；Zm00001d045384在葉中下調(diào)表達(dá)，在莖中上調(diào)表達(dá)；Zm00001d023294在根、穗、葉中上調(diào)表達(dá)，在莖中下調(diào)表達(dá)；Zm00001d019230在莖中下調(diào)表達(dá)；Zm00001d038453在根中下調(diào)表達(dá)；Zm00001d034601在穗、葉中上調(diào)表達(dá)(圖4)。

圖4 玉米耐旱候選基因表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

玉米耐旱性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受眾多微效QTL控制。由于不同研究定位所采用的群體類型、遺傳背景、作圖方法的不同，定位結(jié)果往往不一致。因此，需要整合來(lái)自不同研究的QTL數(shù)據(jù)，利用Meta分析確定MQTL區(qū)域。該研究共收集了211個(gè)玉米抗旱相關(guān)QTL信息，最終得到39個(gè)與玉米耐旱相關(guān)的一致性QTL(Meta-QTL)區(qū)域。在所發(fā)掘的MQTL置信區(qū)間與原始QTL置信區(qū)間相比均有不同程度的縮小，在很大程度上提高了MQTL挖掘的可靠程度。與粟文娟等[22]研究結(jié)果相比較，共得到4個(gè)高度重疊的MQTL區(qū)域，分別為MQTL1、MQTL5、MQTL10和MQTL60以及2個(gè)MQTL相鄰區(qū)域，分別為MQTL9和MQTL13。

該研究通過(guò)與水稻耐旱相關(guān)基因同源比對(duì)，最終在6個(gè)MQTL區(qū)域得到6個(gè)玉米耐旱候選基因。其中，OsSAP1通過(guò)影響一些相同的內(nèi)源基因表達(dá)來(lái)增強(qiáng)植株對(duì)水脅迫的耐受性，阻止轉(zhuǎn)基因植株在逆境中的產(chǎn)量損失。OsNAC5在干旱脅迫下會(huì)上調(diào)水稻中GLP，PDX，MERI5，O-甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，促使水稻根、莖增粗，從而提高水稻抗旱能力和水稻產(chǎn)量。OsNAC10在根中特異表達(dá)，增大了根系，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性。OsAE115在干旱條件下參與油菜素內(nèi)脂信號(hào)和生長(zhǎng)素信號(hào)，正向調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長(zhǎng)，從而影響籽粒大小和產(chǎn)量。GUDK通過(guò)磷酸化和激活OsAP37來(lái)介導(dǎo)干旱脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)，激活脅迫相關(guān)基因提高抗旱性。ALM1編碼一個(gè)定位于葉綠體的超氧化物歧化酶，主要通過(guò)清除植物體內(nèi)過(guò)量的活性氧而維持植物的正常發(fā)育。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)并非所有玉米同源基因與MQTL區(qū)域重疊，例如與OsSKIPa[34]同源的玉米基因Zm00001d028814臨近MQTL3區(qū)域；與OsMFT1[35]同源的玉米基因位于上述區(qū)域以外的染色體其他位置。其原因可能是玉米耐旱QTL定位所用到遺傳群體大多為初級(jí)群體，原始QTL真實(shí)性較低，以及Biomercator 4.2軟件在進(jìn)行一致性圖譜映射時(shí)存在QTL數(shù)據(jù)丟失等問(wèn)題，導(dǎo)致最終結(jié)果存在偏差。