胰腺癌組織中微血管密度和淋巴管密度對(duì)術(shù)后1年內(nèi)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值

陸厚良 喬莎莎 韋有亮 陳瓊

1來賓市人民醫(yī)院病理科，來賓 546100 ； 2來賓市人民醫(yī)院肝膽胰外科，來賓 546100

胰腺癌具有癥狀隱匿、手術(shù)切除率低、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[1]，據(jù)報(bào)道我國45.8%～51.5%的胰腺癌患者術(shù)后1年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。研究發(fā)現(xiàn)，微血管密度(microvessel density，MVD)和淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)在腎癌和肺癌患者癌組織中增高，與腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)[3-4]。但MVD、LVD與胰腺癌術(shù)后腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性尚未見報(bào)道。本研究探討胰腺癌組織中的MVD和LVD對(duì)腫瘤術(shù)后1年內(nèi)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值，旨在為識(shí)別和篩查腫瘤轉(zhuǎn)移的高?；颊咛峁┡R床參考。

資料與方法

一、一般資料

回顧性分析2020年1月至2021年12月間廣西來賓市人民醫(yī)院收治的47例行手術(shù)治療并經(jīng)病理確診為胰腺導(dǎo)管腺癌患者的臨床資料，其中男性33例，女性14例，年齡42～67歲，中位年齡52歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均為無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胰頭癌患者；(2)均行胰十二指腸切除術(shù)；(3)術(shù)后接受規(guī)律隨訪1年。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受抗腫瘤治療；(2)術(shù)中發(fā)現(xiàn)胰頭癌伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；(3)既往患過其他惡性腫瘤；(4)存在嚴(yán)重心、肝、腎、肺基礎(chǔ)疾??；(5)失訪患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

二、隨訪和分組

術(shù)后1年內(nèi)常規(guī)每3個(gè)月復(fù)查血清學(xué)腫瘤指標(biāo)，胸、腹部增強(qiáng)CT或MR。若有不適即隨診。隨診時(shí)懷疑腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(除胰腺外的其他組織器官轉(zhuǎn)移)，行穿刺活檢或PET-CT明確診斷，并記錄腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)間。根據(jù)術(shù)后1年隨訪期內(nèi)腫瘤是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分為無轉(zhuǎn)移組和轉(zhuǎn)移組。

三、MVD和LVD檢測(cè)

分別取癌組織及其匹配的距腫瘤2 cm以上并證實(shí)無癌細(xì)胞的癌旁組織蠟塊標(biāo)本，4 μm 厚度連續(xù)切片，采用免疫組織化學(xué)染色法分別檢測(cè)微血管上皮細(xì)胞CD34表達(dá)，淋巴管上皮細(xì)胞D2-40表達(dá)，染色步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。CD34、D2-40即用型抗體購于福州邁新生物科技有限公司。MVD、LVD分別參照Weidner等[5]、Nakayama等[6]報(bào)道的方法計(jì)算。CD34染色陽性為血管內(nèi)皮細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色著色；D2-40陽性染色定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜。染色后的切片置100倍視野下觀察，排除切緣出血區(qū)域，尋找微血管或淋巴管的分布區(qū)域，然后在400倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)CD34表達(dá)陽性血管數(shù)或D2-40表達(dá)陽性淋巴管數(shù)，取其均值作為MVD或LVD。

四、觀察指標(biāo)

記錄患者性別、年齡、腫瘤長徑、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、腫瘤分期、術(shù)后化療等指標(biāo)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、一般資料

47例胰腺癌患者中3例術(shù)后出現(xiàn)胰瘺，2例出現(xiàn)腸瘺，經(jīng)非手術(shù)治療后均好轉(zhuǎn)出院。24例(51.1%)術(shù)后1年內(nèi)未發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(無轉(zhuǎn)移組)，23例(48.9%)在1年隨訪時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)移組)，轉(zhuǎn)移時(shí)間為3～12個(gè)月，中位時(shí)間9個(gè)月，其中14例出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，8例出現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移，1例出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。

二、胰腺癌組織和正常癌旁組織MVD、LVD

轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組胰腺癌組織的MVD分別為(72.52±9.73)、(63.20±6.52)個(gè)/400倍視野，顯著高于正常癌旁組織的(51.73±7.95)、(54.79±5.80)個(gè)/400倍視野(t值分別為9.34、7.16，P值均<0.001)；轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組胰腺癌組織的LVD分別為(23.78±6.87)、(16.25±5.15)個(gè)/400倍視野，顯著高于正常癌旁組織的(14.00±5.66)、(13.62±5.03)個(gè)/400倍視野(t值分別為8.66、5.71，P值均<0.001)；轉(zhuǎn)移組胰腺癌組織的MVD和LVD分別高于無轉(zhuǎn)移組癌組織的MVD和LVD(t值分別為6.75、6.99，P值均<0.001)；轉(zhuǎn)移組正常癌旁組織的MVD和LVD與無轉(zhuǎn)移組癌旁組織的MVD和LVD差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為-1.13、0.74，P值均>0.05)。

三、胰腺癌組織MVD、LVD與臨床病理特征的關(guān)系

腫瘤長徑≥2 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、TNM高分期患者癌組織的MVD較高(P<0.05，表1)；腫瘤長徑≥2 cm、腫瘤中低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、TNM高分期患者癌組織的LVD較高(P<0.05，表1)。

表1 胰腺癌組織微血管密度和淋巴管密度與臨床病理特征的關(guān)系(個(gè)/400倍視野，

四、MVD、LVD對(duì)胰腺癌術(shù)后1年內(nèi)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線分析顯示，MVD對(duì)胰腺癌術(shù)后1年內(nèi)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的臨界值為70.5個(gè)/400倍視野，AUC值為0.799(95%CI=0.659～0.939)，靈敏度為73.9%，特異度為87.5%(圖1A)。LVD對(duì)胰腺癌術(shù)后1年內(nèi)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的臨界值為20.5個(gè)/400倍視野，AUC值為0.803(95%CI=0.676～0.929)，靈敏度為69.6%，特異度為83.7%(圖1B)。

圖1 微血管密度(1A)、淋巴管密度(1B)預(yù)測(cè)胰腺癌術(shù)后1年內(nèi)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的ROC曲線

五、高、低MVD組和高、低LVD組胰腺癌患者術(shù)后1年內(nèi)累積腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率

以MVD、LVD預(yù)測(cè)術(shù)后1年內(nèi)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的臨界值70.5、20.5個(gè)/400倍視野為界，將患者分為高M(jìn)VD組(17例)和低MVD組(30例)、高LVD組(18例)和低LVD組(29例)。高M(jìn)VD組術(shù)后1年內(nèi)累積腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率顯著高于低MVD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.15、P<0.05，圖2A)；高LVD組術(shù)后1年內(nèi)累積腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率也顯著高于低LVD 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.80、P=0.003，圖2B)。

圖2 高、低微血管密度組(2A)和淋巴管密度組(2B)患者胰腺癌術(shù)后1年內(nèi)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移累積率

六、胰腺癌術(shù)后1年內(nèi)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響因素

單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤長徑≥2 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、術(shù)后無化療、高M(jìn)VD和高LVD患者術(shù)后1年內(nèi)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較高(表2)。多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤長徑≥2 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高M(jìn)VD和高LVD是胰腺癌術(shù)后1年內(nèi)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨(dú)立影響因素(表3)。

表2 47例胰腺癌術(shù)后1年內(nèi)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的單因素分析

表3 胰腺癌術(shù)后1年內(nèi)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的多因素logistic回歸分析

討 論

胰腺癌是惡性程度極高的腫瘤，5年總體生存率僅為5%[7-8]。胰腺毗鄰多處重要臟器和血管，解剖位置特殊，約50%的患者確診時(shí)已失去手術(shù)根治性切除的機(jī)會(huì)，而手術(shù)患者中約80%術(shù)后隨訪中出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，胰周血管和淋巴管豐富，為腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供解剖路徑。胰腺癌細(xì)胞可以通過胰周淋巴結(jié)上行至肝門淋巴結(jié)，最終發(fā)生腹腔或者肝臟轉(zhuǎn)移[9]；還可以通過腸系膜上靜脈回流至門靜脈，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[10]。本研究納入47例胰腺癌患者，共有23例術(shù)后轉(zhuǎn)移，其中60.9%(14/23)發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移，34.8%(8/23)發(fā)生腹腔局部轉(zhuǎn)移，4.3%(1/23)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。

MVD是評(píng)價(jià)腫瘤中單位面積內(nèi)血管數(shù)量常用指標(biāo)，MVD增高提示新生血管增多。新生血管可以為腫瘤細(xì)胞惡性增殖提供大量氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚不完整，腫瘤細(xì)胞容易突破基底膜發(fā)生血管浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)MVD與肝癌、腎癌和食道癌術(shù)后轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以作為評(píng)估預(yù)后的指標(biāo)[11-13]。LVD是指實(shí)體腫瘤組織中淋巴管分布密度，在一定程度上反應(yīng)腫瘤組織毛細(xì)淋巴管的形成速度和密度，而淋巴管密度增加為腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供有利的微環(huán)境[14]。胰頭周圍淋巴交通復(fù)雜，側(cè)支循環(huán)多變，對(duì)于淋巴管微轉(zhuǎn)移術(shù)前常規(guī)MR和PET-CT檢查無法發(fā)現(xiàn)。所以淋巴管密度增加很可能是腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的前提條件。在肝癌研究中發(fā)現(xiàn)，LVD與患者不良病理特征和預(yù)后密切相關(guān)[15]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織MVD和LVD顯著高于正常癌旁組織，隨訪結(jié)果顯示腫瘤1年內(nèi)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組患者癌組織中MVD和LVD也高于無轉(zhuǎn)移組患者。這提示胰腺癌患者術(shù)后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可能與MVD和LVD有關(guān)，癌細(xì)胞可能通過微血管和淋巴管通路發(fā)生遠(yuǎn)處遷移和種植，而單位組織內(nèi)MVD和LVD增高，為癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。進(jìn)一步分析胰腺癌組織中MVD和LVD與臨床病理特征關(guān)系發(fā)現(xiàn)，腫瘤長徑≥2 cm、腫瘤中低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯等患者癌組織中MVD和LVD增高。而這類病理特征被認(rèn)為與胰腺癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)[16-17]。有學(xué)者通過基礎(chǔ)研究證實(shí)了MVD和LVD與胰腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制。血管生成基因CXCL 1和CXCL 8受IL-8和IL-35表達(dá)調(diào)控，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞生成因子上調(diào)，促進(jìn)血管生成，單位組織內(nèi)血管密度增加，促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[18-19]；胰腺癌組織中低氧環(huán)境促進(jìn)淋巴管迷路生成，LVD增高，通過上調(diào)染色體中非編碼基因BANCR表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)淋巴管生成和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[20]。根據(jù)本研究隨訪結(jié)果，23例患者術(shù)后1年內(nèi)發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，MVD、LVD對(duì)術(shù)后1年內(nèi)發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有預(yù)測(cè)作用，最佳預(yù)測(cè)界值分別為70.5個(gè)/400倍視野和20.5個(gè)/400倍視野。同時(shí)高M(jìn)VD和LVD也是胰腺癌術(shù)后1年內(nèi)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在臨床上可以通過分析癌組織的MVD和LVD預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，并根據(jù)患者個(gè)體情況制定適合的術(shù)后復(fù)查隨訪方案，密切跟蹤隨訪腫瘤轉(zhuǎn)移情況，為胰腺癌患者術(shù)后制定復(fù)查方案提供新的思路。

綜上所述，胰腺癌組織MVD和LVD增高，是術(shù)后1年內(nèi)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨(dú)立影響因素，可用于預(yù)測(cè)患者術(shù)后1年內(nèi)有無腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，具有一定臨床意義，但仍需大樣本對(duì)照研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明陸厚良：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、文章撰寫；喬莎莎：實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；韋有亮：參與手術(shù)實(shí)施、數(shù)據(jù)收集；陳瓊：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指導(dǎo)、論文修改