高效液相色譜法測(cè)定天然本草牙膏中綠原酸含量

陳杰鋒 高 艷

(無限極(中國(guó))有限公司，廣東 廣州 510000)

金銀花為忍冬科植物，是一種常用的清熱去火中草藥，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，多用于虛火上升、癰腫疔瘡、溫病發(fā)熱、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒等治療[1]。中草藥牙膏是我國(guó)口腔清潔護(hù)理用品行業(yè)的特色，牙齦炎、牙周炎、牙齦出血等炎癥而多為“上火”引起，在牙膏中添加金銀花，作為日常護(hù)理用品，可以輔助起到清熱去火、消炎等作用。現(xiàn)代藥理研究表明金銀花提取物的主要成分是綠原酸，監(jiān)測(cè)牙膏中綠原酸含量，可以間接反應(yīng)金銀花中草藥在牙膏中的含量以及穩(wěn)定性。因此，研究了牙膏中綠原酸含量的測(cè)定方法，用于檢測(cè)牙膏中綠原酸含量。

1 實(shí)驗(yàn)和方法

1.1 儀器與材料

1)Agilent 1200Series高效液相色譜儀系統(tǒng)(G1329A ALS，G1311A Quat Pump，G1322A Degasser，G1316A TCC，G1315D DAD)；

2)梅特勒-托利多XSE205型電子天平(感量0.01mg)；

3)梅特勒-托利多ML204T型電子天平(感量0.1mg)；

4)昆山市超聲儀器有限公司KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗器；

5)Thermo Fisher Sorvall ST 16R離心機(jī)；

6)IKA MS3渦旋振蕩器；

7)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究所，含量以96.1%計(jì))；

8)植雅牙膏(規(guī)格：140克/支，無限極(中國(guó))有限公司生產(chǎn))；

9)乙腈(色譜純，默克股份兩合公司)；

10)甲醇(色譜純，默克股份兩合公司)；

11)磷酸(優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；

12)石英砂(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；

13)超純?nèi)ルx子水。

1.2色譜條件

1)色譜柱：Waters Xbridge C18(250mm×4.6mm，5μm)；

2)流動(dòng)相：A相(乙腈)，B相(0.1%磷酸溶液)，梯度洗脫，見表1；

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

3)流量：1.0 mL/min；

4)柱溫：30℃；

5)進(jìn)樣量：20μL；

6)檢測(cè)波長(zhǎng)：327nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1)：精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg(精確至0.01mg)至50mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，搖勻，配制成200μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1)。

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(2)：準(zhǔn)確吸取5mL濃度為200μg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1)，于100mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，配制成10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(2)。

1.4 供試品溶液的制備

稱取試樣1g(精確至0.1mg)于50mL具塞刻度離心管中，加入約1g石英砂，再準(zhǔn)確加入甲醇-磷酸混合溶液(甲醇+磷酸+水=50+2+48，體積比)20mL，稱定質(zhì)量，渦旋振蕩2min，35℃水浴中超聲提取30min，冷卻至室溫后用甲醇-磷酸混合溶液補(bǔ)足損失質(zhì)量，5000r/min離心分離10min，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，濾液作為試樣溶液上機(jī)待測(cè)。

1.5 測(cè)定和計(jì)算

按上述條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和待測(cè)溶液，根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間和紫外光譜圖定性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度和色譜峰面積回歸直線方程定量，按公式(1)計(jì)算樣品中綠原酸的含量。

(1)

式中：X——試樣中綠原酸的含量，mg/kg；

C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得出的綠原酸濃度，μg/mL；

V——試樣溶液的體積，mL；

m——試樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的確定

2.1.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)綠原酸的結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)，對(duì)提取溶劑和提取方法進(jìn)行考察，篩選合理的提取方法?？紤]到牙膏試樣在水中分散效果較好，本方法采用有機(jī)溶劑-水體系作為提取溶劑?？疾炝瞬煌壤募状妓芤汉鸵掖妓芤?30%，50%，70%，90%，100%)對(duì)含有綠原酸的牙膏試樣的提取效果，結(jié)果見圖1。使用甲醇水溶液作為溶劑時(shí)，甲醇比例從30%增大到50%，測(cè)得試樣中綠原酸含量逐漸增多，在50%時(shí)，測(cè)得含量最大值，繼續(xù)增大甲醇比例，測(cè)得綠原酸含量逐漸減少。使用乙醇水作為溶劑時(shí)，乙醇比例在30%時(shí)，測(cè)得含量最大值，繼續(xù)增大乙醇比例，測(cè)得綠原酸含量逐漸減少。綜合兩個(gè)溶劑體系對(duì)綠原酸的提取情況，使用50%甲醇水溶液測(cè)得的綠原酸含量最高。同時(shí)，考慮到牙膏一般具有較好的水分散性，提取溶劑中有機(jī)溶劑的比例越高，牙膏在提取溶劑中的分散效果越差。因此選擇50%甲醇-水溶液作為綠原酸的提取溶劑。另外，為了提高牙膏在提取溶劑中的分散效果，本次實(shí)驗(yàn)選擇加入適量石英砂對(duì)牙膏試樣進(jìn)行輔助分散。

圖1 不同比例有機(jī)溶劑水溶液的提取效果對(duì)比

2.1.2 提取溶劑中磷酸濃度的選擇

在提取溶劑中添加一定濃度的磷酸可使碳酸鈣基質(zhì)牙膏溶解更充分，提高綠原酸的提取效率。本次實(shí)驗(yàn)考察了在提取溶劑中添加不同濃度的磷酸(0%，0.5%，1%，2%，4%，6%)(體積分?jǐn)?shù))對(duì)含有綠原酸的牙膏試樣的提取效果，結(jié)果見圖2。隨提取溶劑中磷酸濃度逐漸增大，測(cè)得試樣中綠原酸含量逐漸增多，磷酸濃度在2%時(shí)，測(cè)得含量最大值，繼續(xù)增大磷酸濃度，測(cè)得綠原酸含量有所下降。因此選擇在提取溶劑添加磷酸的濃度為2%，即甲醇-磷酸-水溶液(50+2+48)(體積比)作為綠原酸的提取溶劑。

圖2 提取溶劑中不同磷酸濃度的提取效果對(duì)比

2.2 儀器色譜條件的確定

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過使用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)對(duì)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液在190～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示(見圖3)，綠原酸在紫外光327nm波長(zhǎng)處有最大特征吸收，故本方法選擇327nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外吸收光譜圖

2.2.2 色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了Waters Xbridge C18、Agilent Eclipse Plus C18、Kromasil C18和 Acclaim 120 C18等不同型號(hào)相同規(guī)格(250mm×4.6mm，5μm)的C18色譜柱對(duì)綠原酸和試樣基質(zhì)的分離效果。結(jié)果顯示，在優(yōu)化的流動(dòng)相條件下各種C18色譜柱能實(shí)現(xiàn)綠原酸和試樣基質(zhì)的有效分離，尤其使用Waters Xbridge C18(250mm×4.6 mm，5μm)色譜柱時(shí)，峰形尖銳對(duì)稱。綜合考慮，最終選擇使用C18色譜柱作為分離色譜柱。

2.2.3 流動(dòng)相中磷酸濃度的選擇

綠原酸為含有羥基和鄰二酚羥基的強(qiáng)極性有機(jī)酸[2]，溶于水后會(huì)出現(xiàn)部分解離，容易產(chǎn)生主峰拖尾現(xiàn)象，在流動(dòng)相中加入一定比例的酸，能抑制酸解離，有助于提高主峰與干擾峰的分離度，改善峰形[3,4]。本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液3種流動(dòng)相體系對(duì)綠原酸和試樣基質(zhì)的分離效果。結(jié)果顯示，三種磷酸濃度的流動(dòng)相體系采用梯度洗脫均能夠?qū)崿F(xiàn)綠原酸和試樣基質(zhì)的良好分離，考慮到流動(dòng)相的酸性較大可能會(huì)對(duì)色譜柱的性能和使用壽命造成一定影響。因此，本方法采用乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相。

2.3 線性范圍與檢出限

分別精密量取1.3步驟中綠原酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(2)0.3mL、0.5mL、1.0mL、2.0ml、5.0mL置于10mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液稀釋至刻度，配制成濃度為0.3μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列，依前述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。記錄色譜峰峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出綠原酸的回歸方程為：

y=36.11088x-0.51537

R2=0.9999

由以上回歸方程可知綠原酸在0.3μg/mL～5.0μg/mL之間呈良好線性關(guān)系。

取牙膏試樣按1.4步驟制備待測(cè)溶液，通過將該測(cè)試溶液逐級(jí)稀釋并上機(jī)測(cè)試，測(cè)定目標(biāo)物的信噪比(S/N)，將所得信噪比大于3時(shí)對(duì)應(yīng)的稀釋后濃度作為方法的檢出濃度。結(jié)果顯示，本方法的檢出濃度為0.026μg/mL。當(dāng)試樣稱樣量為1g，溶液定容體積為20mL時(shí)，方法檢出限為0.52mg/kg(此檢出限為采用安捷倫品牌二極管陣列檢測(cè)器測(cè)試所得，如采用其他品牌二極管陣列檢測(cè)器開展測(cè)試，應(yīng)重新確定檢出限，以實(shí)際測(cè)試值為準(zhǔn))。

2.4 方法特異性

本實(shí)驗(yàn)分別考察了3種基質(zhì)牙膏(二氧化硅基質(zhì)、碳酸鈣基質(zhì)和磷酸氫鈣基質(zhì))陰性樣品和添加綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品后的色譜圖。結(jié)果如圖4～9所示，表明三種基質(zhì)中存在的物質(zhì)對(duì)本方法目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)沒有干擾。

圖4 二氧化硅基質(zhì)(陰性樣品)牙膏溶液譜圖

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

分別平行稱取三種不同基質(zhì)牙膏試樣6份，依照1.4步驟制備的供試品溶液，依前述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定綠原酸含量，結(jié)果見表2。6次進(jìn)樣測(cè)得三種不同基質(zhì)牙膏中綠原酸含量平均值分別為16.6mg/kg、16.2mg/kg、10.6mg/kg，RSD分別為1.6%、1.1%、2.4%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

圖5 二氧化硅基質(zhì)(陰性樣品)牙膏加標(biāo)溶液譜圖

圖6 碳酸鈣基質(zhì)(陰性樣品)牙膏溶液譜圖

圖7 碳酸鈣基質(zhì)(陰性樣品)牙膏加標(biāo)溶液譜圖

圖8 磷酸氫鈣基質(zhì)(陰性樣品)牙膏溶液譜圖

圖9 磷酸氫鈣基質(zhì)(陰性樣品)牙膏加標(biāo)溶液譜圖

表2 試樣重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

2.6 中間精密度試驗(yàn)

由不同操作人員A、B，分別對(duì)同一批次牙膏試樣平行稱取試樣6份，依照1.4步驟制備供試品溶液，依前述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定綠原酸含量，結(jié)果見表3。測(cè)得牙膏試樣中綠原酸含量的平均值分別為16.2mg/kg和16.3mg/kg，RSD為1.0%。結(jié)果表明，該方法中間精密度良好。

表3 綠原酸含量測(cè)定的中間精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.7 準(zhǔn)確度(回收率)試驗(yàn)

分別平行稱取3種基質(zhì)(二氧化硅、碳酸鈣、磷酸氫鈣)牙膏試樣(陽(yáng)性樣品)各9份，每份約0.5g(稱樣量減半)，共3組，分別定量加入綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度水平為試樣本底含量的50%、100%、150%，按1.4步驟處理后進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，結(jié)果見表4～6。從表中可看出，三種基質(zhì)牙膏試樣在不同濃度下的平均加標(biāo)回收率為95.8%～101.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～2.3%。結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確可靠，精密度高。

表4 二氧化硅基質(zhì)牙膏試樣加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

表5 碳酸鈣基質(zhì)牙膏試樣加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

表6 磷酸氫鈣基質(zhì)牙膏試樣加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取牙膏試樣按1.4步驟制備供試品溶液，依前述的色譜條件在0h、6h、12h、18h、24h分別進(jìn)樣，測(cè)定綠原酸含量，結(jié)果見表7。牙膏試樣中綠原酸含量平均值為16.1mg/kg，RSD為1.0%，結(jié)果表明，在24小時(shí)內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

表7 放置時(shí)間對(duì)綠原酸測(cè)試結(jié)果的影響

2.9 樣品測(cè)試

分別取6個(gè)不同批次牙膏試樣，依照1.4步驟制備供試品溶液，上機(jī)進(jìn)樣測(cè)定綠原酸含量，結(jié)果分別見表8。

表8 牙膏試樣中綠原酸含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究根據(jù)綠原酸的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，對(duì)提取溶劑和提取方法進(jìn)行了系統(tǒng)考察，并結(jié)合牙膏試樣在水中分散效果較好的特點(diǎn)，通過實(shí)驗(yàn)最終選擇50%甲醇-水溶液作為提取溶劑。同時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)證明，在提取溶劑中添加2%磷酸(體積分?jǐn)?shù))可使碳酸鈣基質(zhì)牙膏溶解更充分，有效提升綠原酸的提取效率。

經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定使用Waters Xbridge C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫：0～10min(12%A)，10～20min(90%A)，20～25min(12%A)；流速1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)327nm；進(jìn)樣量：20μL。結(jié)果表明，此方法條件下綠原酸色譜峰形較理想，分離效果好，綠原酸質(zhì)量濃度在0.3μg/mL～5.0μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2= 0.9999)，將該方法應(yīng)用于牙膏試樣的測(cè)定，其方法特異性、重復(fù)性、中間精密度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度良好，添加3個(gè)濃度水平的平均加標(biāo)回收率為95.8%～101.7%，RSD為0.7%～2.3%。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)不同基質(zhì)的牙膏試樣，利用高效液相色譜法(HPLC)建立了靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便測(cè)定牙膏中綠原酸含量的檢測(cè)方法，可作為天然本草牙膏中關(guān)鍵功效成分的質(zhì)量控制方法，在中草藥牙膏產(chǎn)品的安全質(zhì)量和應(yīng)用研究領(lǐng)域發(fā)揮作用。