48例晚期肺腺癌患者繼發(fā)耐藥后外周血T790M突變對(duì)預(yù)后的影響*

胡愛民，鄭 華，李 琨，高 遠(yuǎn)，劉 贊，張同梅，李寶蘭△

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院/北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所：1.腫瘤內(nèi)科 ；2.病理科 101149)

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)的上市是肺癌治療領(lǐng)域的里程碑，其使EGFR敏感突變的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者無進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)延長，生活質(zhì)量得到改善。但EGFR-TKI耐藥不可避免，多出現(xiàn)在用藥后1年左右[1]，在EGFR-TKI繼發(fā)性耐藥患者中，約50%為T790M突變[2]，多項(xiàng)研究均表明，晚期肺癌患者外周血EGFR基因突變狀態(tài)檢測(cè)，可作為腫瘤組織基因檢測(cè)的重要補(bǔ)充[3-6]，外周血基因檢測(cè)結(jié)果一定程度上可反映患者整體的基因突變狀態(tài)。因此，為研究對(duì)一代EGFR-TKI耐藥的晚期肺腺癌外周血EGFR對(duì)預(yù)后的影響，本研究收集晚期肺腺癌患者耐藥后的外周血，使用超級(jí)擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(super-amplification refractory mutation system,super-ARMS)法檢測(cè)T790M基因突變，并分析其與臨床特征、療效和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院住院病案檢索系統(tǒng)及門診系統(tǒng)，對(duì)2014年5月1日至2016年12月31日的住院患者進(jìn)行檢索，共收集110例接受一代EGFR-TKI治療的晚期肺腺癌患者，篩選出對(duì)一代EGFR-TKI耐藥的患者48例。進(jìn)行回顧性研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)組織學(xué)確診為Ⅲb/Ⅳ肺腺癌患者；(2)患者在治療前已行組織EGFR基因檢測(cè)，明確有EGFR基因敏感突變，且接受EGFR-TKI靶向治療；(3)48例患者均在靶向治療開始后每隔6～8周進(jìn)行CT檢查，直至病情進(jìn)展后收集血液標(biāo)本，并行進(jìn)展后組織活檢。

1.2 方法

1.2.1收集資料

資料內(nèi)容記錄包括患者的性別、年齡、吸煙、確診日期和進(jìn)展日期，美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)體力功能狀態(tài)評(píng)分，TNM分期(2015年第7版分期標(biāo)準(zhǔn))，最初EGFR突變，一代TKI藥物名稱，耐藥后進(jìn)展類型(局部進(jìn)展或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)，進(jìn)展后血液T790M突變狀態(tài)，組織T790M突變狀態(tài)。符合上述入組標(biāo)準(zhǔn)的患者共48例，年齡37～78歲，中位年齡62歲。其中，男22例，女26例。不吸煙患者(不吸煙規(guī)定為一生吸煙少于100支)所占比例64.6%(31/48)。ECOG評(píng)分為0～1分47例，2～3分1例。ⅢB期8例，Ⅳ期40例。所有患者在治療前均經(jīng)組織活檢明確有EGFR基因敏感突變，其中19-Del突變31例，21-L858R突變17例，均無原發(fā)性T790M突變。EGFR-TKI作為二線及以上治療占43.8%(21/48)。初始EGFR-TKI治療中位PFS為11.7個(gè)月。

1.2.2樣本采集、分離及實(shí)驗(yàn)方法

所有患者在胸部CT檢查提示病情進(jìn)展后，采集清晨空腹靜脈血5 mL，置于帶有血清分離凝膠的離心管內(nèi)，于抽血后2 h內(nèi)分離血漿，首先2 000×g 離心10 min，取上層血清；再8 000×g 離心10 min，取上清液，按Qiagen (55114)QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit試劑盒說明書，提取外周血游離DNA，立即進(jìn)行檢測(cè)，否則放置于-20 ℃保存。將待測(cè)樣本DNA質(zhì)量濃度稀釋到1～3 ng/μL，利用多重?zé)晒釶CR法(人類EGFR突變基因檢測(cè)試劑盒，廈門艾德)，檢測(cè)所有樣本的EGFR驅(qū)動(dòng)基因突變。用SLAN96S實(shí)時(shí)熒光PCR儀(上海宏石)進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min,1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性40 s，64 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，15個(gè)循環(huán)；93 ℃變性40 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)。

1.2.3結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3.1EGFR基因突變狀態(tài)判斷

按說明書提供的判讀原則，用ΔCt值(Ct突變-Ct外控)確定標(biāo)本EGFR基因突變：當(dāng)Ct突變小于28、T790M ΔCt突變小于或等于7，判斷為突變陽性。反之則為陰性或低于本試劑盒的檢測(cè)下限。

1.2.3.2療效評(píng)價(jià)

靶向治療開始后，每2個(gè)月進(jìn)行CT影像學(xué)檢查。近期療效參照實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)RECIST 1.1制定，分為完全緩解(complete response,CR)、部分緩解(partial response,PR)、穩(wěn)定(stable disease,SD)和進(jìn)展(progressive disease,PD)，CR+PR為有效。PFS定義為從EGFR-TKI治療的第1天開始到疾病進(jìn)展、死亡和最后1次隨訪。OS定義為從疾病確診的第1天開始至死亡或最后1次隨訪的時(shí)間。

1.2.4隨訪

采用首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院病案管理系統(tǒng)及門診系統(tǒng)，通過電話和復(fù)診等方式進(jìn)行隨訪，48例患者無失訪。隨訪至2020年2月1日。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2或Fisher’s檢驗(yàn)；采用壽命表和Kaplan-Meier 方法計(jì)算生存率、中位生存期，繪制生存曲線，Log-rank 檢驗(yàn)生存率差異，采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 48例一代EGFR-TKI耐藥的晚期肺腺癌患者PFS影響因素分析

48例晚期肺腺癌繼發(fā)耐藥患者中，骨轉(zhuǎn)移33例(68.8%，33/48)，顱內(nèi)轉(zhuǎn)移18例(37.5%，18/48)，肝轉(zhuǎn)移9例(18.8%，9/48)，單純胸腔內(nèi)轉(zhuǎn)移6例(12.5%，6/48)。中位PFS為11.7個(gè)月，中位OS為30.4個(gè)月。單因素分析顯示一代EGFR-TKI治療的PFS與外周血T790M突變及一代EGFR-TKI治療藥物有關(guān)(P=0.021、0.040)；血T790M突變陽性患者比T790M突變陰性患者PFS更長(12.4個(gè)月vs.9.4個(gè)月)，且一代TKI藥物作為二線治療的比一線治療的患者中位PFS更長(14.6個(gè)月vs.10.4個(gè)月)，見表1。多因素分析顯示，PFS僅與外周血T790M突變與有關(guān)，而OS與患者年齡、性別、吸煙狀況、外周血T790M突變、一代EGFR-TKI藥物治療線數(shù)及耐藥后進(jìn)展類型均無關(guān)，見表2。

表1 48例一代EGFR-TKI耐藥的晚期肺腺癌患者PFS影響因素分析

表2 48例一代EGFR-TKI耐藥晚期肺腺癌患者PFS及OS的多變量COX模型分析

2.2 48例一代EGFR-TKI耐藥的晚期肺腺癌患者血T790M基因突變的影響因素分析

48例晚期肺腺癌患者中，血檢T790M陽性突變26例(54.2%)，血T790M基因突變的影響因素與耐藥后進(jìn)展類型有關(guān)，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者更容易出現(xiàn)血T790M突變陽性(χ2=10.018，P=0.002)，見表3。

表3 48例一代EGFR-TKI耐藥晚期肺腺癌患者血T790M突變的影響因素分析[n(%)]

續(xù)表3 48例一代EGFR-TKI耐藥晚期肺腺癌患者血T790M突變的影響因素分析[n(%)]

3 討 論

一代EGFR-TKI治療出現(xiàn)影像學(xué)進(jìn)展后，組織活檢仍是T790M突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[7-9]，但組織標(biāo)本獲取較困難、標(biāo)本有限、質(zhì)量不可控制，而液體活檢標(biāo)本易得、重復(fù)獲取容易、能克服腫瘤異質(zhì)性，是有力的補(bǔ)充。本研究對(duì)有EGFR敏感突變的晚期肺腺癌患者，在一代EGFR-TKI治療進(jìn)展后，采用super-ARMS檢測(cè)血T790M基因，結(jié)果顯示，在48例繼發(fā)耐藥患者中，血T790M突變陽性率54.2%(26/48)。多項(xiàng)研究表明，在一代EGFR-TKI耐藥的患者中，外周血標(biāo)本中EGFR基因T790M基因突變陽性率低于組織標(biāo)本，外周血T790M突變陽性率為16.6%～32.4%[3-6]。GAO等[10]在105例中國患者中，ARMS檢測(cè)出的T790M陽性率為54%。本組采用第二代ARMS檢測(cè)技術(shù)super-ARMS，在引物基礎(chǔ)上添加了成環(huán)結(jié)構(gòu)，提高了拷貝模板的特異結(jié)合能力，具有高度的選擇性和敏感性。有研究發(fā)現(xiàn)，初始突變?yōu)?9-Del的患者相較于L858R突變的患者更容易發(fā)生T790M突變[11]。本組患者血T790M突變陽性率偏高，可能因?yàn)闃颖玖枯^小，且19-Del患者較多(64.6%，31/48)，尚需更多的研究來探索其原因。本研究結(jié)果證實(shí)，通過super-ARMS檢測(cè)血T790M基因，是組織活檢的有力補(bǔ)充。

本組結(jié)果單因素分析顯示，一代EGFR-TKI耐藥后血T790M突變陽性患者比T790M突變陰性患者PFS更長(12.4個(gè)月vs.9.4個(gè)月)，且一代TKI藥物作為二線治療的比一線治療的患者PFS更長(14.6個(gè)月vs.10.4個(gè)月)。而多因素分析顯示，PFS僅與血T790M突變狀態(tài)有關(guān)。OXNARD等[12]發(fā)現(xiàn)，一代TKI治療進(jìn)展后有T790M突變陽性的進(jìn)展后生存期明顯長于無T790M突變患者，還有研究發(fā)現(xiàn)，T790M突變陽性出現(xiàn)的概率在曾經(jīng)或還在接受EGFR-TKI治療的患者中更高(61.9%，26/42)[13]，這可能與長期EGFR-TKI治療對(duì)T790M耐藥突變的誘導(dǎo)有關(guān)，而不是在NSCLC進(jìn)展的自然過程中發(fā)生。本組48例患者中，有21例將一代TKI作為二線治療，主要為厄洛替尼(16/21)，其PFS更長。其可能原因：(1)臨床研究發(fā)現(xiàn)厄洛替尼相比吉非替尼及?？颂婺嵊懈L的PFS；(2)經(jīng)過一線化療后，腫瘤負(fù)荷減輕，治療效果相對(duì)會(huì)更好；(3)經(jīng)過多線治療后EGFR耐藥基因可被激活從而誘導(dǎo)耐藥突變的發(fā)生。目前晚期肺癌EGFR突變陽性患者的治療模式有靶向聯(lián)合化療、序貫化療等，但關(guān)于不同模式治療療效的研究相對(duì)較少。靳海濤[14]對(duì)入組64例晚期NSCLC患者進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與先靶向后化療治療方法相比，采用先化療后靶向治療近期臨床療效明顯，但兩種治療方法對(duì)患者PFS及OS無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本組多因素分析顯示，一代TKI的治療線數(shù)并不影響PFS和OS，尚需大樣本的前瞻性研究來證實(shí)。

本研究結(jié)果還顯示，血T790M基因突變的影響因素與耐藥后進(jìn)展類型有關(guān)，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者更容易出現(xiàn)血T790M突變陽性。這可能是因?yàn)檫h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的腫瘤突變負(fù)荷更高，在血液中更容易檢測(cè)到。本組中骨轉(zhuǎn)移33例(68.8%，33/48)，顱內(nèi)轉(zhuǎn)移18例(37.5%，18/48)，肝轉(zhuǎn)移9例(18.8%，9/48)，單純胸腔內(nèi)轉(zhuǎn)移6例(12.5%，6/48)。有研究發(fā)現(xiàn)，T790M突變與耐藥后轉(zhuǎn)移部位有關(guān)，161例患者中共有74例T790M突變，其中，有骨轉(zhuǎn)移的患者T790M的突變率為61.9%，而有腦轉(zhuǎn)移的患者T790M的突變率為38.5%，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[15]。ZHANG等[16]將患者分為胸腔內(nèi)轉(zhuǎn)移、顱內(nèi)轉(zhuǎn)移和其他(其他遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及多發(fā)轉(zhuǎn)移)3組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第3組患者更易發(fā)生T790M突變。該結(jié)論對(duì)于一代EGFR-TKI療效的臨床評(píng)估具有指導(dǎo)意義。

目前三代EGFR-TKI靶向藥奧西替尼已廣泛應(yīng)用于對(duì)一代靶向耐藥后出現(xiàn)T790M突變的晚期NSCLC患者。它通過與EGFR激酶區(qū)ATP結(jié)合域的半胱氨酸-797殘基不可逆共價(jià)結(jié)合，抑制其下游信號(hào)通路，從而抑制腫瘤增殖；體外實(shí)驗(yàn)也證明，奧西替尼與T790M突變的EGFR親和力是野生型的200倍[17]。全球Ⅲ期臨床研究AURA3試驗(yàn)表明，與標(biāo)準(zhǔn)化療相比，奧西替尼的中位PFS明顯增加(4.4個(gè)月vs.10.1個(gè)月)，客觀緩解率也明顯提高(31%vs.71%)，中位緩解持續(xù)時(shí)間明顯增加(4.1個(gè)月vs.9.7個(gè)月)。

綜上所述，檢測(cè)T790M突變具有重大的臨床價(jià)值，尤其是液體活檢可以作為組織學(xué)檢測(cè)的補(bǔ)充手段，有利于及早發(fā)現(xiàn)耐藥，指導(dǎo)患者的個(gè)體化治療。由于本文為回顧性研究，還需要更多的樣本量和前瞻性研究來證明此結(jié)論。