AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在鼻咽癌演進過程中的表達水平研究*

陶維平，彭 亞，李湘勝

(湖南省長沙市第四醫(yī)院耳鼻喉科 410006)

鼻咽癌是指發(fā)生在鼻咽部的惡性腫瘤，現(xiàn)在的人們生活和工作壓力、環(huán)境污染均比較大，導致鼻咽癌的發(fā)病率較高[1-2]。癥狀在早期多不典型，隨著腫瘤的生長，逐步出現(xiàn)一系列的癥狀，如鼻出血、頭疼，鼻咽癌也可以出現(xiàn)耳悶、鼻塞、鼻涕中帶血的情況，比較嚴重的情況就會出現(xiàn)淋巴結腫大、視力障礙、呼吸困難等，對身體的影響較大，使患者備受折磨。鼻咽癌和顱內相通，易導致顱內的損傷和感染，若不及早進行治療會危及生命[3-4]。目前對于鼻咽癌首選的治療方法為放射治療，根治性的治療多適用于全身狀況良好的患者。據(jù)報道，膜聯(lián)蛋白A7(AnnexinA7)、核苷酸切除修復交叉互補基因1(ERCC1)、人類白細胞抗原F(HLA-F)在體內參與多種生理病理過程，促進細胞增殖、抑制凋亡，調控血管生成等，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在部分腫瘤如肺癌、直腸癌、乳腺癌等組織中高表達，并在腫瘤的轉移和侵襲中發(fā)揮重要作用。但是，AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在鼻咽癌組織中表達情況及對鼻咽癌細胞生長的影響尚未明確[5-6]。本文旨在通過分析AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在鼻咽癌組織中的表達水平，以為AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在鼻咽癌的研究提供依據(jù)和方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年4月至2021年3月于本院進行手術治療的鼻咽癌患者78例，其中男41例，女37例，年齡28～85歲，平均(56.5±22.8)歲。納入標準：(1)經(jīng)X射線、CT檢查黏膜下的組織有早期病變；(2)鼻咽部有腫物,腫物活檢證實為癌變；(3)臨床病歷資料齊全；(4)無全身感染及嚴重貧血；(5)無腫瘤復發(fā)及轉移。排除標準：(1)近期接受放化療；(2)患有嚴重高血壓、心臟病者；(3)肝、腎功能障礙者；(4)合并器官腫瘤者；(5)精神異常，不能積極配合溝通治療者。取患者術中切除的癌組織及癌旁組織(距離癌組織邊緣2 cm之內的非癌組織)行免疫組織化學(IHC)染色，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第7版分期標準，組織學類型中非角化型癌30例，角化型癌48例；T分期中T1期24例，T2～4期54例；N分期中N0期21例，N1～3期57例；臨床綜合分期中Ⅱ期7例，Ⅲ期31例，Ⅳ期40例。本研究患者及家屬均知情同意，并獲本院倫理委員會批準[2020倫審第(65)號]。

1.2 方法

1.2.1標本采集及IHC染色

所有癌組織、癌旁組織5 μm厚度切片，行常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0，0.01 mol/L)95 ℃加熱30 min，取出冷卻，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗。滴加0.3%過氧化氫阻斷劑，4%脫脂奶粉，恒溫孵育30 min后PBS清洗3次，滴加山羊血清，26 ℃環(huán)境中培養(yǎng)0.5 h，添加一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，取出后PBS清洗，滴加二抗兔抗羊IgG(1∶1 000)，再次孵育30 min，再與抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物孵育30 min，使用PBS清洗，3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色處理8 min，蘇木精染色，反藍、脫水處理后封片，顯微鏡觀察(200倍)，使用ImageJ軟件分析AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達的積分光密度值。

1.2.2IHC染色檢測AnnexinA7、ERCC1、HLA-F的表達水平

將鼻咽癌組織切片放置60 ℃烤箱，拷片2 h，使用二甲苯反復脫蠟3次，每次10 min，梯度乙醇水化，用蒸餾水沖洗5 min。將切片放置塑料染色架上，放入含0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸組織抗原緩沖液容器中，加熱15～20 min，冷卻。蒸餾水沖玻片洗2次，PBS沖洗3次。過氧化物酶阻斷劑15 min，PBS沖洗3次，每次3 min。稀釋滴加1滴一抗(1∶1 000稀釋)，放入4 ℃冰箱保存；次日取出放置30 min，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS，切片滴加50 μL MaxVisionTM試劑，40 ℃孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS，切片滴加DAB顯色試劑顯色。3～5 min后沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核1 min，沖洗反藍。梯度乙醇脫水，二甲苯透明10 min，風干，封片，顯微鏡觀察(200倍)。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在兩組標本組織中的表達水平比較

IHC染色結果顯示，鼻咽癌組織中陽性染色細胞陽性顆粒主要定位于細胞質，癌組織中AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達水平明顯高于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1、表1。

A:AnnexinA7;B:ERCC1;C:HLA-F。

表1 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在兩組組織標本中的表達水平比較

2.2 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F與鼻咽癌臨床病理因素的關系

AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在不同性別、年齡的鼻咽癌中表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；在不同組織學類型及T、N分期差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與Ⅱ期鼻咽癌患者比較，Ⅲ、Ⅳ期管鼻咽癌患者AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達水平明顯升高(P<0.05)；與Ⅲ期鼻咽癌患者比較，Ⅳ期管鼻咽癌患者AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達水平明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F與鼻咽癌臨床病毒因素的關系

續(xù)表2 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F與鼻咽癌臨床病毒因素的關系

2.3 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F單一及聯(lián)合檢測對鼻咽癌的預測價值

與AnnexinA7、ERCC1、HLA-F單一指標檢測比較，AnnexinA7、ERCC1、HLA-F聯(lián)合檢測對鼻咽癌的預測價值明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見表3、圖2。

表3 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F單一及聯(lián)合檢測對鼻咽癌的預測價值

圖2 AnnexinA7、ERCC1、HLA-F單一及聯(lián)合檢測預測鼻咽癌的ROC曲線圖

2.4 鼻咽癌組織中AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達水平相關性分析

對鼻咽癌組織中AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達相關性進行分析。鼻咽癌組織中AnnexinA7與ERCC1、HLA-F表達水平呈正相關(r=0.537、0.652，P=0.001)；ERCC1與HLA-F表達水平呈正相關(r=0.479，P=0.001)，見表4。

表4 鼻咽癌組織中AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達水平相關性分析

3 討 論

鼻咽癌是臨床上很常見的一種惡性腫瘤，主要發(fā)生的部位是鼻咽，多發(fā)生于南方地區(qū)。目前發(fā)病原因并不是很清楚，通常跟EB病毒感染、遺傳、環(huán)境等因素有一定的聯(lián)系[7-8]。鼻咽癌發(fā)生位置有些隱蔽，早期不易發(fā)現(xiàn)，只有通過定期檢查才能發(fā)現(xiàn)。鼻咽癌對放療最敏感，早期的鼻咽癌甚至有治愈的可能，但局部病灶復發(fā)、轉移仍是導致死亡及預后欠佳的關鍵因素。因此，尋找一種針對鼻咽癌患者的診治及預后判斷相關的標志蛋白是臨床重要研究方向[9-10]。

AnnexinA7基因定位于人類染色體，是一種可促進膜融合、黏著的鈣依賴性磷脂結合蛋白，受三磷酸鳥苷(GTP)酶的調控[11]。有研究顯示，AnnexinA7在喉癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤呈高表達，在疾病的發(fā)展、轉歸中占據(jù)重要角色[12-13]。葉衛(wèi)華等[14]研究發(fā)現(xiàn)，AnnexinA7在胃癌中表達下調可明顯抑制癌細胞增殖，具有抑癌作用，其蛋白表達水平與胃癌的預后不良具有密切聯(lián)系。本研究結果顯示，AnnexinA7在鼻咽癌組織中呈高表達，與T、N分期明顯相關(P<0.05)，且高分期癌組織表達相對較高，與其在胃癌組織中表達相似，提示AnnexinA7可促進多種蛋白的表達，可能激活了Ras-Raf-MAPK相關通路，促進腫瘤細胞的增殖和分化，抑制細胞凋亡，且其表達水平與患者淋巴結轉移、臨床分期等病理特征具有一定相關性，進而影響參與鼻咽癌發(fā)生演進。

ERCC1是核酸切除修復家族中重要的基因，具有識別DNA鏈切割、損傷的雙重功能，其表達水平可直接影響DNA修復的生理過程[15]。有研究顯示，ERCC1表達異?？赡苡绊懕茄拾┗颊呋熕幬锆熜?，其通過蛋白表達作用于基因改變[16-17]。鼻咽癌組織中ERCC1表達的相關研究在國內外報道較少，研究結果具有偏倚，與選取樣本及地域不同、樣本量較少有關。有研究表明，ERCC1在鼻咽癌組織中的陽性表達低于癌旁組織，并認為ERCC1表達異常及癌變可能與DNA修復酶基因作用在上皮細胞形成內積聚體有關[18]。本研究顯示，鼻咽癌ERCC1呈現(xiàn)異常表達，并發(fā)現(xiàn)與癌旁組織比較，鼻咽癌組織中ERCC1表達水平明顯增高(P<0.001)；在臨床綜合分期中，其臨床分期越晚，ERCC1表達水平越高。

HLA-F是HLAⅠ類分子重要成員之一，在T淋巴細胞、腫瘤、先天免疫細胞表面表達中的消耗起著重要作用。研究顯示，HLA-F的表達具有廣泛性，在除絨毛外滋養(yǎng)細胞外的所有有核細胞表面都有表達，在不同腫瘤類型如肝癌、非小細胞肺癌、胃癌中也均有表達，且其在不同腫瘤中表現(xiàn)出了不同的臨床相關性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了不同程度的推動作用[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，HLA-F在鼻咽癌中的表達是影響預后的獨立因子，且HLA-F表達與腫瘤浸潤程度、血管及淋巴管侵犯、轉移等相關[2]。本研究顯示，淋巴結轉移數(shù)量增多鼻咽癌癌組織中HLA-F表達相對較高，說明HLA-F的表達與淋巴結轉移存在一定相關性，其可作為診斷鼻咽癌患者的生物標志物。

綜上所述，本文通過對AnnexinA7、ERCC1、HLA-F在鼻咽癌組織中表達及臨床意義的研究發(fā)現(xiàn)，AnnexinA7、ERCC1、HLA-F表達水平與鼻咽癌患者淋巴結轉移情況、腫瘤分級相關，且三者的異常表達，可能共同參與鼻咽癌發(fā)展演進過程，對鼻咽癌的診斷有一定的臨床價值。但本研究由于選取病例數(shù)較少，具有局限性，故在下一步研究中，可擴大研究范圍、增加樣本量，進一步探究AnnexinA7、ERCC1、HLA-F的表達變化及臨床意義。