2 129例流感樣住院患者呼吸道13項(xiàng)病原體檢測結(jié)果分析*

鄭盼盼，李 楠，榮瑞娟，張子鳳，張 菁，孫一嬋，趙維麗，李 洋，劉贊朝,△

(石家莊市第二醫(yī)院：1.河北省糖尿病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.石家莊市糖尿病精準(zhǔn)診療技術(shù)創(chuàng)新中心 050051)

急性呼吸道感染(acute respiratory infections，ARI)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的感染性疾病，病死率也很高[1]。病毒性ARI是兒童和老年人住院及門診就診的主要原因之一[2]，其治療費(fèi)用及病死率均較高[3]。由于癥狀非特異和缺乏快速敏感的診斷方法，病毒性ARI患者經(jīng)驗(yàn)性抗生素的應(yīng)用，不僅延誤治療時(shí)機(jī)也增加了耐藥性[4]。傳統(tǒng)的診斷技術(shù)如直接免疫熒光抗體法和病毒分離培養(yǎng)，作為曾經(jīng)病原體檢測的主要方法，耗時(shí)耗力[5]。可同時(shí)檢測多種主要呼吸道病毒的高敏感和特異度的GeXP遺傳分析平臺(tái)的出現(xiàn)，為研究常見ARI中多種病原體提供了條件。本研究利用GeXP遺傳分析平臺(tái)聯(lián)合多重反轉(zhuǎn)錄-PCR(mRT-PCR)的方法[6]，同時(shí)檢測甲型流感病毒(InfA)、InfAH1N1、季節(jié)性流感病毒H3N2(H3)、乙型流感病毒(InfB)、人腺病毒(HADV)、博卡病毒(Boca)、人鼻病毒(HRV)、人副流感(HPIV)、冠狀病毒(HCOV)、人呼吸道合胞病毒(HRSV)、人偏肺病毒(HMPV)和肺炎支原體(MP)、衣原體(Ch)等13項(xiàng)主要呼吸道病毒和非經(jīng)典微生物，分析其在本院住院患者中的流行特征及致病情況，以期為臨床的精準(zhǔn)診斷與治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年12月1日至2020年12月31日在本院住院患者中伴有流感樣并開展13項(xiàng)主要呼吸道病毒和非經(jīng)典微生物檢測的2 129例患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)急性上呼吸道感染，病程小于3 d，發(fā)熱(腋下體溫大于或等于38 ℃)，伴咳嗽或咽痛、鼻塞、流涕、咳痰等上呼吸道癥狀；(2)資料完整；(3)患者同意參加本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院48 h才診斷為AR1；(2)因非感染性因素所致的呼吸道急性炎癥；(3)實(shí)質(zhì)器官或造血干細(xì)胞移植，有人類免疫缺陷病毒(HIV)感染及艾滋病(AIDS)等免疫缺陷疾病，以及癌癥化療患者；(5)資料不全或不同意參加本研究的患者。本研究經(jīng)石家莊市第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意,患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。采集所有患者臨床科室、住院號(hào)、年齡、性別、就診日期等臨床基本信息。其中，女960例(45.09%)，男1 169例(54.91%)，男女比例1.22∶1.00；年齡21 d～101歲，平均(54.50±27.08)歲。

1.2 方法

1.2.1樣本采集

所有患者入院前均顯示新型冠狀病毒(簡稱新冠)核酸檢測陰性。鼻咽拭子樣本由臨床醫(yī)生使用專用拭子采集后放入加有1 mL生理鹽水的專用試管，置于4 ℃冰箱冷藏并在24 h內(nèi)送檢。

1.2.2核酸提取

新冠肺炎疫情期間核酸提取過程均進(jìn)行相應(yīng)等級(jí)的防護(hù)、相關(guān)人員均完成培訓(xùn)。利用重鼎生物技術(shù)有限公司的核酸提取BD-Micro型試劑盒，按操作要求進(jìn)行核酸提取。

1.2.3mRT-PCR擴(kuò)增

采用13項(xiàng)呼吸道病原體多重檢測試劑盒(寧波海爾施基因科技有限公司)。mRT-PCR反應(yīng)體系和程序參照試劑盒配套說明書。

1.2.4GenomeLabTMGeXP表達(dá)遺傳分析平臺(tái)

mRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在美國貝克曼庫爾特有限公司的GenomeLabTMGeXP平臺(tái)中根據(jù)片段大小不同、遷移速率不同被分離，后結(jié)合產(chǎn)物熒光信號(hào)強(qiáng)度的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.5結(jié)果判定

在全部16對上、下游引物的5′端分別加入一段非同源性序列作為通用引物，構(gòu)成特異性嵌合引物，嵌合引物擴(kuò)增出的預(yù)期片段(±1.5 nt)信息如下：InfA(105.0 nt)、InfAH1N1(163.3 nt)、H3(244.9 nt)、InfB(212.7 nt)、HADV(110.2～113.9 nt)、Boca(121.6 nt)、HRV(129.6 nt)、HPIV(181.6 nt)、HCOV(265.1 nt)、HRSV(280.3 nt)、HMPV(202.8 nt)、MP(217.0 nt)、Ch(190.5 nt)，內(nèi)部參照IC(Internal Control，315.9 nt)。經(jīng)PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳后的樣品除靶基因片段還有人DNA(235.5 nt)、人RNA(148.6 nt)和IC內(nèi)參，即滿足有人DNA、人RNA特征峰，且峰度高于標(biāo)準(zhǔn)品，提示待檢樣本合格，IC峰正常的條件下再對比核酸檢測結(jié)果峰型，判讀陰、陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(n)和百分率(%)表示，兩組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病原檢出情況

共采集臨床住院流感樣患者2 129例，檢測出呼吸道病原陽性1 008例，總陽性檢出率為47.35%(1 008/2 129)。其中InfA 349例陽性最多，陽性檢出率為16.39%(349/2 129)，其次為H3 173例和HRV 158例，陽性檢出率分別為8.13%(173/2 129)、7.42%(158/2 129)，見表1。兩種及以上病原體混合感染264例，陽性檢出率為12.40%(264/2 129)。其中InfA和H3兩種及以上病原體的感染例數(shù)最多，161例，占陽性檢出例數(shù)的60.98%(161/264)，明顯高于其他兩種及以上病原體混合感染的組別(P<0.01)，見表2。

表1 13項(xiàng)病原的陽性檢出[n(%),n=2 129]

表2 兩種及以上病原體混合感染檢出陽性[n(%),n=264]

2.2 不同性別患者病原的分布情況

入選2 129例流感樣患者中女960例，陽性517例，陽性檢出率為53.85%(517/960)，病原體感染率為24.28%(517/2 129)；男1 169例，陽性491例，陽性檢出率為42.00%(491/1 169)，病原體感染率為23.06%(491/2 129)。其中女性InfA、H3病毒陽性檢出率及總病原體陽性檢出率明顯高于男性(P<0.01)，見表3。

表3 不同性別患者病原檢測陽性率比較[n(%)]

2.3 不同年齡組患者病原的分布情況

分析結(jié)果顯示，各個(gè)年齡組均有病原體檢測陽性患者，其中小于3歲組、60～<75歲組、≥75歲組是病原體的易感年齡，且多種病原體易感。InfA、H3和HRV病毒陽性可見于各個(gè)年齡組。3歲以下兒童、60歲及以上老人是病毒易感人群，且HRSV和Ch多見于兒童，HPIV和HCOV多見于老年人，見圖1。

A：<3歲；B：3～<7歲；C：7～<15歲；D：15～<20歲；E：20～<40歲；F：40～<60歲；G：60～<75歲；H：≥75歲。

2.4 不同季節(jié)病原體檢測陽性患者的分布情況

2019年12月至2020年1月(冬季)病例數(shù)600，陽性患者例數(shù)443，陽性率為73.83%(443/600)；2020年2-4月(春季)病例數(shù)603，陽性患者例數(shù)97，陽性率為16.09%(97/603)；2020年5-7月(夏季)病例數(shù)369，陽性患者例數(shù)34，陽性率為9.21%(34/369)；2020年8-10月(秋季)病例數(shù)302，陽性患者例數(shù)49，陽性率為16.22%(49/302)；2020年11-12月(冬季)病例數(shù)255，陽性患者例數(shù)43，陽性率為16.86%(43/255)。其中2019年12月至2020年1月的冬季患者陽性率明顯高于包括2020年11-12月的冬季在內(nèi)的其他季節(jié)(P<0.001)。2020年夏季患者陽性率明顯低于其他季節(jié)(P<0.01)。此外，新冠肺炎疫情防控常態(tài)化后的2020年11-12月冬季病例，其呼吸道病原體的陽性檢出率明顯低于新冠疫情初發(fā)的2019年12月至2020年1月冬季病例的陽性檢出率(16.86%vs.73.83%，P<0.01)。呼吸道病原體陽性患者的季節(jié)性分布情況，見圖2。

圖2 病原體陽性患者的季節(jié)分布情況

3 討 論

呼吸道病毒感染是ARI的主要致病原因之一，尤其在上呼吸道感染中，病毒感染為70%～80%，而在下呼吸道感染中6%～61%致病原因是病毒感染[7]。病毒性ARI在我國不同的地區(qū)存在較大差異[8]，目前全國性的呼吸道病毒感染流行病學(xué)數(shù)據(jù)仍較少，尤其在新冠肺炎疫情爆發(fā)后呼吸道病毒感染病毒譜的變化研究還缺乏[9-10]。人群對呼吸道病毒普遍易感，病毒類型繁多，快速正確地診斷呼吸道病毒感染，對臨床早期診治和傳染病防控均具有重要意義。病毒體外分離培養(yǎng)是病毒感染病原學(xué)檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)長、陽性率低且部分致病病毒體外分離培養(yǎng)受限，其他檢測方法主要包括抗體檢測、抗原檢測及核酸檢測[11]。核酸檢測具有快速、靈敏、簡便及單次可檢測多種病毒核酸的優(yōu)點(diǎn)，尤其在新冠肺炎疫情期間，病毒核酸檢測對疫情防控發(fā)揮了重大作用。目前國內(nèi)針對呼吸道病毒的檢測項(xiàng)目多靶向7～9種，本研究所采用的是基于毛細(xì)管電泳多重PCR的核酸檢測方法，靶向11種常見呼吸道病毒及MP、Ch這2種非經(jīng)典微生物，共13項(xiàng)，在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行檢測，檢測通量大、特異度強(qiáng)、靈敏度高，且檢測病原混合感染的能力強(qiáng)，提高了呼吸道病毒感染尤其是多病原感染的高通量實(shí)驗(yàn)室檢測水平，在實(shí)現(xiàn)臨床資源節(jié)約的同時(shí)，可對進(jìn)行區(qū)域呼吸道病毒感染流行病學(xué)研究提供技術(shù)上的極大便利。

本研究收集了2019年12月1日至2020年12月31日的診斷有ARI的住院病例，13項(xiàng)呼吸道病原體多重檢測的總陽性率47.35%。對比相近地區(qū)北京懷柔26.78%總陽性率的研究報(bào)道[12]，本研究總陽性率較高的原因可能是因?yàn)榧{入對象為住院患者，且多患有較嚴(yán)重的基礎(chǔ)性疾病，以及應(yīng)用抗感染藥物使呼吸道病毒和非經(jīng)典微生物的感染增加，也與檢測病原體種類數(shù)量、檢測方法、空氣污染指數(shù)、分析年限等因素有關(guān)。本研究病毒感染普分析顯示，InfA(16.39%)陽性率最高，與石家莊市第一醫(yī)院研究結(jié)果(InfA陽性率19.1%)相似[13]，也與人流感主要由InfA病毒感染引起的普遍認(rèn)知相符[14]。由于InfA變異率較高，是引起世界范圍內(nèi)流感爆發(fā)流行的主要因素，且重癥患者主要發(fā)生在老年人和兒童中[8，15]，因此也一直被重視。根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《流行性感冒診療方案2020版》建議：應(yīng)盡早給予抗流感病毒治療，包括奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋在內(nèi)的神經(jīng)氨酸酶抑制劑對甲型、乙型流感病毒均有效，血凝素抑制劑阿比多爾也可用于甲型流感的治療[16]。此外，H3(8.13%)和HRV(7.42%)陽性率僅次于InfA，且見于各個(gè)年齡組。同時(shí)感染InfA和H3(161例)在兩種及以上病原混合感染中最多，占比60.98%。因此，H3和HRV應(yīng)和InfA一樣引起臨床醫(yī)師的重視。

在本地及相近地區(qū)不同性別和不同年齡的呼吸道病原譜的研究報(bào)道顯示，河北地區(qū)女性呼吸道病原體陽性總檢出率高于男性[13]，在北京市住院病例呼吸道病原流行特征顯示，<5歲、≥60歲的患者陽性檢出率最高[17]。本研究中盡管男性病例多于女性，但女性中病原體陽性檢出率仍明顯高于男性(53.85%vs.42.00%,P<0.01)，與上述報(bào)道相符，這可能是由于女性免疫力相對較低或受激素水平的影響導(dǎo)致。在不同年齡組患者病原譜分析中，<3歲、≥60歲是呼吸道病毒及非經(jīng)典微生物的易感年齡，且對多種病原體易感，應(yīng)作為ARI防控的重點(diǎn)人群。

通常ARI具有季節(jié)性流行特征，在冬季感染率最高。由于本研究分析年限處在新冠肺炎疫情爆發(fā)初期至1年后之間的特殊時(shí)期，因此，對新冠肺炎疫情爆發(fā)初期的冬季和防控常態(tài)化后的第1個(gè)冬季進(jìn)行了呼吸道病原流行比較分析。結(jié)果表明疫情防控常態(tài)化后同季節(jié)ARI呼吸道病原感染陽性檢出率有了明顯的降低(P<0.01)，但新冠肺炎疫情以來，呼吸道病毒及非經(jīng)典微生物仍存在春冬季多發(fā)、夏季散發(fā)的季節(jié)分布差異，醫(yī)師仍需警惕季節(jié)性感冒在住院患者中的流行。疫情防控常態(tài)化后ARI明顯降低與疫情爆發(fā)后民眾良好的個(gè)人防護(hù)習(xí)慣、政府對疫情防控的高度重視、針對性的健康宣教等有關(guān)[18]，這一系列措施有效阻斷疫情蔓延的同時(shí)也有效減少了呼吸道疾病的傳播，對提高全民公共衛(wèi)生健康意識(shí)起到了極大推動(dòng)作用。

綜上所述，盡管新冠肺炎疫情爆發(fā)后的針對性防護(hù)措施對呼吸道病原的感染形成了遏制作用，但ARI仍存在性別、年齡和季節(jié)差異。及時(shí)進(jìn)行本地區(qū)住院患者的病原學(xué)檢測對精準(zhǔn)診療InfA 、H3和HRV等主要病原體感染，以及合理用藥十分重要，≥60歲老年人、≤3歲兒童應(yīng)作為防控的重點(diǎn)人群，尤其是高齡和(或)具有糖尿病、心肺疾病等基礎(chǔ)疾病的高危人群，以免引起嚴(yán)重的后果。