miRNA-146a通過JAK/STAT3信號通路對燒沖復(fù)合傷大鼠心臟功能的影響*

姜萬嵩，韓庚奮，劉 成，張成生，張景陽，馬 驍△，姚興偉

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六九醫(yī)院:1.衛(wèi)勤處；2.骨科，呼和浩特 010051)

燒沖復(fù)合傷是熱力、沖擊波相繼或同時作用于機(jī)體造成的復(fù)合傷，可能發(fā)生在煤氣泄漏、礦難、交通意外、化工廠等意外爆炸中，致殘率及病死率較高[1-2]。有研究顯示，燒沖復(fù)合傷的超壓可引起心臟受損，導(dǎo)致心肌組織發(fā)生炎性反應(yīng)、變性甚至壞死[3]。謝鋒等[4]研究發(fā)現(xiàn)，燒沖復(fù)合傷大鼠的心肌細(xì)胞凋亡增加，心臟功能受到嚴(yán)重?fù)p害，如果人體受到燒沖復(fù)合傷會造成其心臟受損，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及生命安全。因此，探究其發(fā)生的可能機(jī)制對于保護(hù)心臟具有重要意義。微RNA(miRNA)是一類進(jìn)化高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，在免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)等環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用，miRNA-146a位于第5號染色體上，是參與炎性應(yīng)答的重要miRNA之一[5]。有研究顯示，心臟收縮功能障礙小鼠心肌組織中miRNA-146a呈現(xiàn)低表達(dá)，上調(diào)miRNA-146a后可明顯改善心臟功能[6]。李靜等[7]研究認(rèn)為，miRNA-146a降低與心肌組織受損密切相關(guān)，提高miRNA-146a表達(dá)后可明顯減輕心肌炎性反應(yīng)，對心臟損傷具有一定的保護(hù)作用。Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(JAK/STAT3)信號通路在炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，與心臟功能損傷聯(lián)系密切。LI等[8]研究顯示，激活心肌組織中JAK/STAT3通路可降低急性心肌梗死小鼠心肌炎性反應(yīng)，對心臟具有一定的保護(hù)作用，但關(guān)于miRNA-146a、JAK/STAT3通路與燒沖復(fù)合傷大鼠心臟受損之間的研究較少。因此，本研究通過建立燒沖復(fù)合傷大鼠模型，探究miRNA-146a通過JAK/STAT3信號通路對燒沖復(fù)合傷大鼠心臟功能的影響，為臨床治療燒沖復(fù)合傷心臟功能損傷保護(hù)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物

48只SPF級SD雄性大鼠(浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，生產(chǎn)許可證號為SCXK(浙)2019-0001，體重約為210 g。大鼠均在本院動物房飼養(yǎng)，12 h晝夜交替，自由飲食、飲水，動物房溫度25 ℃左右，相對濕度50%左右，保持動物房干凈、通風(fēng)，定時清潔鼠籠。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)同意。實驗過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2主要試劑及儀器

爆炸致傷裝置由中國兵器工業(yè)研究院提供；JAK/STAT3通路抑制劑AG490(133550-30-8)購自美國MCE公司；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、Masson染色試劑盒、蛋白質(zhì)提取試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：G1121、G1340、BC3711、PC0020、SEKR-0002、SEKR-0009、SEKR-0005)購自北京索萊寶科技有限公司；肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、ELISA試劑盒(貨號：ab285275、ab246529)購自英國Abcam公司；miRNA-146a agomir、miRNA-146a agomir陰性對照、miRNA-146a和U6引物購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、β-actin兔源抗體、羊抗兔IgG二抗(貨號：ab32101、ab108596、ab76315、ab68153、ab9485、ab6127)購自英國Abcam公司；多功能酶標(biāo)儀(EnSight)購自美國PerkinElmer公司；光學(xué)顯微鏡(ContourGT-X3)購自美國Bruker公司；組織勻漿機(jī)(Tissuelyser-192)購自上海靜信實業(yè)發(fā)展有限公司；RT-qPCR儀(Step One TM)購于美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1動物模型制備及分組給藥

48只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為對照組、模型組、miRNA-146a陰性對照組(陰性對照組)、miRNA-146a過表達(dá)組(過表達(dá)組)、JAK/STAT3通路抑制劑AG490組(AG490組)、miRNA-146a過表達(dá)+AG490組(聯(lián)合組)，每組8只，除對照組，其余大鼠均構(gòu)建燒沖復(fù)合傷大鼠模型。

燒沖復(fù)合傷大鼠模型的構(gòu)建參考文獻(xiàn)[9]，并適當(dāng)修改，造模大鼠麻醉后剔除背部25%的毛發(fā)并固定于鼠架上，放于距離爆炸源50 cm處的爆炸實驗現(xiàn)場，爆炸源為5 g黑索金炸藥，建立中度沖擊傷模型；接著將大鼠背部脫毛區(qū)域置于94 ℃熱水中12 s，形成約20%的燒傷，獲得燒沖復(fù)合傷大鼠模型，用聚維酮碘消毒大鼠燙傷創(chuàng)面防止感染，腹腔注射生理鹽水防休克，觀察到大鼠呼吸急促、進(jìn)食量減少、精神萎靡等癥狀為模型構(gòu)建成功。對照組大鼠僅進(jìn)行背部脫毛并浸入37 ℃溫水中12 s。造模前6 h禁食不禁水，造模過程中出現(xiàn)不符合條件或死亡現(xiàn)象，及時用備用大鼠進(jìn)行造模處理。

動物給藥參照說明書及文獻(xiàn)[10]，過表達(dá)組、陰性對照組分別經(jīng)尾靜脈注射miRNA-146a agomir慢病毒、miRNA-146a agomir陰性對照各20 μg，術(shù)前每周注射2次，共注射2周；AG490組于術(shù)前24 h尾靜脈注射5 mg/kg AG490[11]，同時以與過表達(dá)組同樣的方法尾靜脈注射等量生理鹽水；聯(lián)合組于術(shù)前每周尾注射miRNA-146a agomir慢病毒20 μg 2次，共注射2周后，于術(shù)前24 h尾靜脈注射5 mg/kg AG490；對照組、模型組以同樣的方法尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.2.2大鼠心功能相關(guān)指標(biāo)測定

造模結(jié)束后24 h，對各組大鼠行超聲心動圖檢查，記錄大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)、左心室收縮壓(LVSP)。用乙醇對大鼠腹部皮膚進(jìn)行消毒處理，切開皮膚暴露主動脈后取血約4 mL，低溫靜置30 min后離心15 min(3 000 r/min)，取血清，采用CK-MB、cTnⅠ ELISA試劑盒測定其中CK-MB、cTnⅠ水平。

超聲心動圖檢查結(jié)束后進(jìn)行血流動力學(xué)指標(biāo)的測定，分離大鼠右頸總動脈并結(jié)扎遠(yuǎn)心端，通過聚乙烯微管系統(tǒng)充入0.3%肝素進(jìn)行抗凝處理，將導(dǎo)管插入頸動脈、升主動脈，待壓力值穩(wěn)定10 min后采用多道生理儀記錄左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室收縮末壓(LVESP)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)。

1.2.3大鼠心肌組織HE及Masson染色觀察

取適量大鼠心肌組織，置于4%多聚甲醛中約24 h進(jìn)行固定處理，用由低到高濃度梯度的乙醇進(jìn)行脫水處理，用二甲苯溶液進(jìn)行透明處理，用融化的石蠟進(jìn)行包埋處理，蠟塊凝固后切片處理，將得到的石蠟切片放入二甲苯中脫蠟，用無水乙醇洗去二甲苯后經(jīng)過不同濃度乙醇處理、蒸餾水沖洗，各選取3張切片分別進(jìn)行蘇木素染色、水洗、返藍(lán)液返藍(lán)、水洗、伊紅染色及Masson染色，水洗、乙醇和二甲苯處理后進(jìn)行風(fēng)干、封片，得到病理組織切片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并分析。具體操作步驟參考HE及Masson染色試劑盒。

1.2.4大鼠心肌組織炎癥因子水平檢測

取適量大鼠心肌組織，用組織勻漿機(jī)制成心肌組織勻漿，低溫離心后取上清液，根據(jù)TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒中的操作要求測定各組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子表達(dá)水平。

1.2.5大鼠心肌組織miRNA-146a表達(dá)檢測

取適量大鼠心肌組織，采用RNA提取試劑盒提取心肌組織中的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，對miRNA-146a進(jìn)行擴(kuò)增，采用RT-qPCR儀測定心肌組織中miRNA-146a表達(dá)水平。miRNA-146a上游引物：5′-GGG TGA GAA CTG AAT TCC A-3′，下游引物：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；以U6為內(nèi)參，上游引物：5′-GCT TCG GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，下游引物：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。反應(yīng)體系有上下游引物各0.5 μL、cDNA 1 μL、SYBR Mix 10 μL，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，根據(jù)2-ΔΔCT算法分析miRNA-146a mRNA表達(dá)。

1.2.6Western blot檢測大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

取適量大鼠心肌組織，經(jīng)預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈后在冰上將其剪成小顆粒，根據(jù)蛋白提取試劑盒的要求提取心肌組織中的總蛋白，采用BCA試劑盒測定其中蛋白濃度，將各組蛋白濃度調(diào)至相同，加熱變性后自然冷卻，取20 μL待測樣品液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)實驗分離蛋白，將分離的蛋白經(jīng)過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，根據(jù)分子量將目的蛋白條帶剪下置于孵育盒中，加入兔源p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3、GAPDH(1∶1 000稀釋)，4 ℃冰箱中孵育過夜，用TBST緩沖溶液漂洗后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h后用TBST緩沖溶液漂洗，經(jīng)過顯影后用Image-J軟件分析相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)比較

與對照組比較，模型組大鼠LVEF、LVSP、LVFS值明顯降低(P<0.05)，血清CK-MB、cTnⅠ水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陰性對照組及AG490組，上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；過表達(dá)組LVEF、LVSP、LVFS值明顯升高(P<0.05)，血清CK-MB、cTnⅠ水平明顯降低(P<0.05)。與過表達(dá)組比較，聯(lián)合組大鼠LVEF、LVSP、LVFS值明顯降低(P<0.05)，血清CK-MB、cTnⅠ水平明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)比較

2.2 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)比較

與對照組比較，模型組大鼠LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR值明顯降低(P<0.05)，LVEDP明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陰性對照組及AG490組，上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，過表達(dá)組LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR值明顯升高(P<0.05)，LVEDP明顯降低(P<0.05)；與過表達(dá)組比較，聯(lián)合組大鼠LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR值明顯降低(P<0.05)，LVEDP明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)比較

2.3 各組大鼠心肌組織損傷比較

對照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、分布均勻，心肌組織結(jié)構(gòu)無明顯損害；模型組大鼠心肌細(xì)胞壞死較嚴(yán)重且排列紊亂，出現(xiàn)肌纖維束斷裂、炎性細(xì)胞浸潤、纖維化變性等現(xiàn)象；與模型組比較，陰性對照組及AG490組大鼠心肌組織損害情況類似，過表達(dá)組大鼠心肌組織損傷得到一定的恢復(fù)；與過表達(dá)組比較，聯(lián)合組大鼠心肌組織損傷較嚴(yán)重，見圖1、2。

A：對照組；B：模型組；C：陰性對照組；D：過表達(dá)組；E：AG490組；F：聯(lián)合組。

A：對照組；B：模型組；C：陰性對照組；D：過表達(dá)組；E：AG490組；F：聯(lián)合組。

2.4 各組大鼠心肌組織炎癥因子表達(dá)水平比較

與對照組比較，模型組大鼠心肌組織炎癥因子表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陰性對照組及AG490組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，過表達(dá)組心肌組織炎癥因子表達(dá)水平降低(P<0.05)；與過表達(dá)組比較，聯(lián)合組大鼠心肌組織炎癥因子表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠心肌組織炎癥因子表達(dá)水平比較

2.5 各組大鼠心肌組織miRNA-146a表達(dá)水平比較

與對照組比較，模型組大鼠心肌組織miRNA-146a表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，陰性對照組及AG490組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，過表達(dá)組心肌組織miRNA-146a表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與過表達(dá)組比較，聯(lián)合組大鼠心肌組織miRNA-146a表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與陰性對照組比較；d：P<0.05，與過表達(dá)組比較；e：P<0.05，與AG490組比較。

2.6 各組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

與對照組比較，模型組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，陰性對照組和AG490組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，過表達(dá)組心肌組織JAK/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與過表達(dá)組比較，聯(lián)合組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見表4、圖4。

表4 各組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

A：對照組；B：模型組；C：陰性對照組；D：過表達(dá)組；E：AG490組；F：聯(lián)合組。

3 討 論

燒沖復(fù)合傷是現(xiàn)代工業(yè)、爆炸材料研究中常見的創(chuàng)傷，其造成的傷害由兩個或兩個以上傷害因素同時或相繼造成的復(fù)合損傷，從而對人體造成更嚴(yán)重的傷害[12-13]。與單純燒傷相比，燒沖復(fù)合傷發(fā)病機(jī)制更加復(fù)雜，從而增加了其治療難度[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，燒沖復(fù)合傷會導(dǎo)致大鼠心臟功能明顯受損，對大鼠的生命體征及傷情造成負(fù)面影響[15]。其中，瞬間快速的血流動力學(xué)變化是造成心臟受損的主要原因。CHAI等[16]研究表明，目前常用爆炸聯(lián)合94 ℃熱水燒傷的方法構(gòu)建燒沖復(fù)合傷動物模型，該方法構(gòu)建的模型較穩(wěn)定且較接近實際，具有爆炸參數(shù)清晰、爆炸載荷穩(wěn)定、易控制等優(yōu)點。本研究采用此方法構(gòu)建燒沖復(fù)合傷大鼠模型后發(fā)現(xiàn)，燒沖復(fù)合傷大鼠的LVEF、LVSP、LVFS、LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、心率水平明顯降低，血清CK-MB、cTnⅠ、LVEDP水平明顯升高，心肌組織受損嚴(yán)重，炎癥因子水平明顯升高，提示燒沖復(fù)合傷可引起大鼠心肌組織損害、引發(fā)心肌炎癥及纖維化變性，導(dǎo)致心功能嚴(yán)重受損，本研究結(jié)果表明，采用爆炸聯(lián)合94 ℃熱水燒傷的方法構(gòu)建燒沖復(fù)合傷動物模型是一種均勻穩(wěn)定的沖擊波，條件易于控制，重復(fù)性佳，且可以對大鼠整體受到?jīng)_擊，而非單一器官損傷，表明本研究模型構(gòu)建成功。

miRNA是長度約為18～22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等疾病的發(fā)生、發(fā)展中占有重要地位[17]。研究表明miRNA-146a與冠心病、缺血性腦卒中等動脈粥樣硬化疾病密切相關(guān)[18]。大量炎癥因子的釋放是導(dǎo)致心臟組織損傷的主要原因之一，TNF-α可導(dǎo)致心臟炎性反應(yīng)級聯(lián)放大，可激活炎性細(xì)胞，進(jìn)而對心肌細(xì)胞造成損傷，損害心臟功能，趙思嘉等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146a高表達(dá)可抑制自身免疫性心肌炎大鼠的心肌炎性反應(yīng)。另外，miRNA-146a可能是通過與TNF-α受體相關(guān)蛋白及IL-1受體相關(guān)激酶結(jié)合，抑制TNF-α等相關(guān)炎癥因子的表達(dá)及釋放，從而改善心肌炎大鼠的心臟功能[20]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中miRNA-146a表達(dá)降低，提示miRNA-146a可能參與了燒沖復(fù)合傷所致心臟功能受損的發(fā)生及發(fā)展過程。與模型組比較，過表達(dá)組大鼠心臟功能低下及心肌組織受損得到緩解，心肌組織中炎癥因子水平降低，表明miRNA-146a過表達(dá)可抑制燒沖復(fù)合傷大鼠心肌炎癥及纖維化變性，并改善其心臟功能，推測miRNA-146可能通過抑制心肌組織中TNF-α、IL-6及IL-1β炎癥因子水平，從而阻止心肌組織炎性反應(yīng)，較少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，達(dá)到治療的目的。

JAK是Janus家族成員，STAT是JAK的下游信號因子，可被JAK激活并發(fā)生磷酸化，STAT3磷酸化后形成二聚體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核及線粒體內(nèi)，進(jìn)而通過轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用，JAK/STAT3信號通路在心肌細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用，有研究顯示，激活JAK/STAT3對心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用[21]。XIN等[22]研究發(fā)現(xiàn)，激活JAK/STAT3通路可降低急性心肌梗死大鼠的心肌細(xì)胞凋亡及心肌組織損傷，對于改善其心臟功能具有一定的積極作用。SAWASHITA等[23]研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT3通路的激活可減輕心肌缺血再灌注損傷，對于心臟具有一定的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，過表達(dá)組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平升高；與過表達(dá)組比較，聯(lián)合組大鼠心肌組織JAK/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)降低，提示過表達(dá)miRNA-146a可提高燒沖復(fù)合傷大鼠心功能，可能是通過激活JAK/STAT3通路減輕心肌組織炎性反應(yīng)，從而達(dá)到改善大鼠心臟功能，促進(jìn)心肌組織恢復(fù)。

綜上所述，miRNA-146a過表達(dá)可抑制燒沖復(fù)合傷大鼠心肌炎癥及纖維化變性，并改善其心臟功能，可能是通過激活JAK/STAT3通路而實現(xiàn)，但燒沖復(fù)合傷大鼠心臟功能損傷的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，miRNA-146a對燒沖復(fù)合傷大鼠的其他作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。