南洞庭湖地區(qū)楊樹清理跡地典型植物葉際微生物群落結(jié)構(gòu)

鄧 楠，田育新，宋慶安，田 菲，馬豐豐①，羅學(xué)衛(wèi)，李德先，嚴(yán)靜芬

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.湖南慈利森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，湖南 慈利 427200；3.益陽市南洞庭湖自然保護(hù)區(qū)沅江市管理局，湖南 沅江 413100)

洞庭湖為長江流域僅有的兩個大型通江湖泊，是我國第2大淡水湖和全球生態(tài)優(yōu)先保護(hù)區(qū)[1-3]。自20世紀(jì)70年代以來，由于天然林保護(hù)工程的實(shí)施和國家木材需求的增長，洞庭湖區(qū)域引入以楊樹為主的速生用材林作為護(hù)堤防浪林和抑螺血防林，為發(fā)展地方經(jīng)濟(jì)，擴(kuò)大了湖區(qū)楊樹種植面積；90年代后期，楊樹在東洞庭湖的漉湖、資江三角洲、湘江三角洲，南洞庭湖西部洲灘以及西洞庭湖目平湖洲灘呈塊狀大片分布。1987—2014年，西洞庭湖楊樹林面積從0增長到10 153 hm2，到2011年楊樹林面積持續(xù)增加，2011年實(shí)施的“退林還濕”工程砍伐了部分區(qū)域的楊樹，致使楊樹林面積減少至2014年水平[4]。楊樹的大面積種植引起了生物多樣性、生境、濕地群落結(jié)構(gòu)和功能等方面的連鎖影響。2017年，中央環(huán)保督察組在對湖南的反饋中指出湖區(qū)大面積種植歐美黑楊已嚴(yán)重威脅洞庭湖生態(tài)安全，要求將洞庭湖自然保護(hù)區(qū)核心區(qū)內(nèi)的楊樹全部清理。2017年10月湖南省林業(yè)廳制定出緩沖區(qū)、實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)楊樹清理退出方案，要求采取科學(xué)措施，修復(fù)被破壞的濕地生態(tài)系統(tǒng)。該方案提出2018、2019和2020年分別退出楊樹總面積的30%、40%和30%，到2020年，全面清理退出。對防護(hù)林、抑螺林進(jìn)行樹種調(diào)整，并實(shí)施生態(tài)修復(fù)；恢復(fù)濕地4.33萬hm2，整治岸線11.14 km、洲灘168處，濕地保護(hù)率穩(wěn)定在72%以上。楊樹清理后，產(chǎn)生了大量清理跡地，為此，湖南省林業(yè)廳制定相關(guān)方案，對清理跡地采取以自然修復(fù)為主、以人工修復(fù)為輔的技術(shù)手段，通過清理采伐剩余物、除樹兜、除萌、封育、封溝育洲和平溝育洲等修復(fù)措施，逐步恢復(fù)植被和濕地生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及生物多樣性。

自然環(huán)境中，植物地上和地下組織中都存在微生物群落，葉際微生物一般是指生活在植物地上部分、主要棲息于葉片的微生物群落[5]。葉際微生物生存的葉面總面積超過1億km2，約為全球陸地面積的兩倍[6]，據(jù)估計(jì)，其細(xì)菌個體總數(shù)約為1026個，而真菌數(shù)量可能要低于細(xì)菌總數(shù)[7-8]。葉際微生物可改變宿主的功能或環(huán)境適應(yīng)性，進(jìn)而影響植物的分布和生態(tài)功能[9]。通常來說，葉際微生物對宿主會產(chǎn)生有利、有害及中性作用[5,10-11]。目前，已有研究表明葉際微生物對宿主的有利作用包括改變宿主微環(huán)境、促進(jìn)生長、作為外源基因載體以及吸附和降解環(huán)境污染物等。葉際中獲得的鞘單胞菌屬(Sphingomonasspp.)能夠分泌吲哚乙酸等促進(jìn)植物生長[12]。有研究表明在非豆科植物中的葉際微生物與根際微生物相似，葉際中存在大量固氮菌，在植物的固氮[13]、硝化作用和溶解磷酸鹽[14]過程中起到重要作用。丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)菌株產(chǎn)生的生物活性分子及蛋白酶體抑制劑Syringolin A通過引導(dǎo)氣孔關(guān)閉來阻止病原體的進(jìn)入[15]。隨著高通量測序技術(shù)及生物信息分析工具的快速發(fā)展，微生物群落與植物互作關(guān)系已成為重要熱點(diǎn)和前沿[16]，但植物與微生物互作研究大部分集中于根際微生物[17]。相比較而言，葉際微生物群落研究隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展正逐漸成為熱點(diǎn)之一[18]。

以南洞庭湖楊樹清理跡地天然更新的楊樹(Populusspp.)、苔草(Carexspp.)、蘆葦(Phragmitescommunis)、南荻(Triarrhenalutarioriparia)以及原有的蘆葦群落葉際微生物為研究對象，通過基于16S rRNA/ITS1片段的HiSeq高通量測序技術(shù)，解析不同植物群落葉際真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及組成差異，為洞庭湖楊樹清理跡地生態(tài)修復(fù)提供理論支持，也為理解葉際微生物與宿主植物的互作關(guān)系提供更多案例。

1 材料與方法

1.1 采樣地點(diǎn)與方法

研究地點(diǎn)位于湖南省沅江市南洞庭湖，楊樹清理跡地天然更新后地表主要植被為蘆葦、南荻、蒼耳(Xanthiumsibiricum)、臭牡丹(Clerodendrumbungei)、豆瓣菜(Nasturtiumofficinale)、附地菜(Trigonotispeduncularis)、蔞蒿(Artemisiaselengensis)、婆婆納(Veronicadidyma)、水蓼(Polygonumhydropiper)、苔草和通泉草(Mazusjaponicus)等，選取蘆葦群落(編號：LW，28°49′23.35″ N，112°30′13.20″ E)、南荻群落(編號：ND，28°50′3.61″ N，112°29′55.94″ E)、苔草群落(編號：TC，28°51′38.60″ N，112°33′39.06″ E)和楊樹群落(編號：YS，28°54′39.71″ N，112°30′58.92″ E)代表性優(yōu)勢植物群落，同時選取該區(qū)附近原生的蘆葦群落(編號：CK，28°49′23.38″ N，112°30′13.35″ E)進(jìn)行對比。采樣時間為2019年9月24日，葉際微生物的采集選擇無雨、霧、露的上午9:00—10:30。在每個群落分別取3棵不同植株個體，選定植株離地面3 m(楊樹)、20～30 cm(蘆葦和南荻)和4～8 cm(苔草)高度的東、西南和西北3個方向的葉片，戴上無菌手套平均采摘3個完整、無病蟲害斑點(diǎn)的葉片，用1×PBS Buffer(Coolaber, China)浸泡固定，置于4 ℃條件下保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后儲存于-20 ℃冰箱。

1.2 葉片微生物DNA提取

將收集的樣品于室溫條件下在搖床上振蕩30 min(200 r·min-1)，使微生物細(xì)胞從葉片表面脫落。在無菌環(huán)境中使用真空抽濾裝置將振蕩液中的微生物收集到0.22 μm孔徑濾膜上，使用Fast DNA spin kit試劑盒(Qbiogene, Irvine, USA)提取濾膜上的總DNA，將提取到的總DNA溶解于100 μL的dd H2O，于-20 ℃條件下低溫保存。

1.3 16S rRNA/ITS基因的高通量測序

利用Illumina Hiseq測序平臺分別對15個樣品的細(xì)菌16S rRNA基因的V4區(qū)和真菌ITS1 rDNA基因的ITS1區(qū)進(jìn)行測序，細(xì)菌和真菌的測序總樣本數(shù)為30個。擴(kuò)增細(xì)菌引物為515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3′[19]。真菌引物為 ITS5F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS1R：TGCGTTCTTCATCGATGC[20]。將擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠(1.8 g·L-1)電泳檢測純化效果，測定純化后產(chǎn)物濃度，將純化產(chǎn)物等摩爾數(shù)混合，以備上機(jī)前純化和測序儀分析用。

1.4 注釋與分析

利用QIIME軟件(v 1.8.0)對下機(jī)后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行序列過濾，篩除葉綠體來源和線粒體來源的序列，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。利用Mothur軟件去除嵌合體序列獲得有效序列，以備后續(xù)分析用。通過QIIME軟件的UCLUST工具，對獲得的有效序列按照序列相似度(97%)進(jìn)行OTU(operational taxonomic unit)劃分和聚類，結(jié)合環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫UNITE(https:∥unite.ut.ee/)、Silva(Release128/132， http:∥www.arb-silva.de)和RDP(V16， http:∥rdp.cme.msu.edu/)注釋獲得每個OTU所對應(yīng)的分類學(xué)信息[21-23]。

α、β及譜系多樣性基于OTU進(jìn)行計(jì)算。α多樣性通常指一個群落內(nèi)物種數(shù)和每個物種的數(shù)量及分布，如物種豐富度和Shannon指數(shù)，以及隨著測序技術(shù)發(fā)展出的Chao1指數(shù)和譜系多樣性；β多樣性用于度量在地區(qū)尺度上物種組成沿著某個梯度方向從一個群落到另一個群落的變化率[24]。筆者研究中α多樣性分析參數(shù)包括物種豐富度、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)及譜系多樣性，Chao1指數(shù)用于通過觀測數(shù)據(jù)推算理論的物種豐富度，包含未觀測到的豐富度，該參數(shù)對稀有物種較為敏感[25]；譜系多樣性基于系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行計(jì)算，將某一個樣品中的所有代表序列的枝長加和，得到數(shù)值。β多樣性采用Bray-Curtis相異矩陣和UniFrac距離進(jìn)行計(jì)算，用于分析微生物群落的波動性及比較群落間β多樣性。在上述參數(shù)中，數(shù)值越大，表示對應(yīng)的群落多樣性就越高。

不同植物群落細(xì)菌、真菌組成差異通過Bray-Curtis相異矩陣進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)。此外，多個分組之間及內(nèi)部的比較采用LDA Effect Size分析(Lefse)[26]，獲得組間在豐度上有顯著差異的物種(biomarker)，然后，通過線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維并計(jì)算差異顯著物種的影響力(LDA score)，初設(shè)閾值為3。

2 結(jié)果與分析

2.1 洞庭湖濕地生態(tài)恢復(fù)過程中典型植物葉際細(xì)菌群落多樣性

2.1.1細(xì)菌群落的α多樣性

測序結(jié)果表明CK、LW、ND、TC和YS 5個群落細(xì)菌測序獲得的有效序列分別為162 599、147 951、119 792、77 932和97 393條，經(jīng)過處理后獲得的OTU數(shù)量分別為298、337、210、125和173條。LW的OTU數(shù)量最多，其次是CK，TC數(shù)量最少。所有植物群落葉際細(xì)菌OTU共注釋到334屬56種，其中，LW群落獲得的注釋最多。不同植物群落葉際細(xì)菌多樣性比較見圖1，5個植物群落Chao1指數(shù)、物種豐富度和譜系多樣性分布較為相似。在5個植物群落中，TC-CK、YS-CK、TC-LW和YS-LW物種豐富度之間存在顯著性差異(P<0.05)；兩兩之間的Shannon指數(shù)均存在顯著差異，5個群落Shannon指數(shù)由大到小依次為YS、TC、LW、CK和ND，YS群落Shannon指數(shù)最高，ND群落最低；5個群落譜系多樣性沒有顯著差異。CK葉際細(xì)菌多樣性參數(shù)與新生蘆葦無顯著差異，說明蘆葦葉際細(xì)菌群落多樣性較為穩(wěn)定，受環(huán)境影響較??；CK與ND葉際細(xì)菌多樣性無顯著差異，說明兩者葉際細(xì)菌群落較為相似，同時，CK葉際細(xì)菌Shannon多樣性顯著低于TC，但Chao1指數(shù)高于TC；此外，YS是喬木樹種，其葉際細(xì)菌Shannon多樣性顯著高于其他草本群落，但其Chao1多樣性要低于蘆葦，研究結(jié)果表明蘆葦葉際中可能還存在部分未觀測到的細(xì)菌種類及稀有物種。

2.1.2細(xì)菌群落的β多樣性與物種組成

不同群落間細(xì)菌β多樣性結(jié)果〔圖2(a)〕表明，YS群落細(xì)菌β多樣性顯著高于其他一年生草本植物群落，而其他4個群落之間差異不顯著?；贐ray-Curtis矩陣對不同群落細(xì)菌組成差異進(jìn)行PCA分析〔圖2(b)〕，發(fā)現(xiàn)前兩個軸共解釋總變量的73.69%，其中，PC1和PC2分別解釋總變量的48.44%和25.25%。從各群落的排序來看，每個群落的生物學(xué)重復(fù)相互聚集，表明重復(fù)性較好，且群落間差異明顯。從PC1軸來看，YS葉際細(xì)菌群落的組成與其他群落差異較大，而其他草本群落結(jié)構(gòu)較為相似。

A為物種豐富度；B為Chao1指數(shù)；C為Shannon指數(shù)；D為譜系多樣性指數(shù)。*表示在0.05水平上顯著，箱型圖從上沿到下沿分別表示數(shù)據(jù)的最大值、上四分位數(shù)、中位數(shù)、下四分位數(shù)和最小值。YS、TC、LW、CK和ND分別為楊樹、苔草、新生蘆葦、原生蘆葦和南荻群落。圖1 細(xì)菌多樣性指數(shù)箱型圖Fig.1 Box plot of bacterial diversity index

細(xì)菌OTU注釋結(jié)果〔圖2(c)〕表明，在所有植物群落中細(xì)菌豐度較高門綱類分別為γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)和丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)，其中，YS、TC、LW、CK和ND群落中γ-變形菌綱豐度占比分別為14.21%、48.99%、71.93%、88.30%和90.20%。從細(xì)菌群落組成來看，原生的CK群落與新生的ND群落更加接近，其次是新生的LW群落，表明新生的蘆葦群落葉際細(xì)菌處在對環(huán)境的適應(yīng)過程中。由于生態(tài)位差異，喬本的YS葉際細(xì)菌群落與草本群落的差異較大。由圖2(d)可知，喬本的YS與其他草本群落差異加大，YS豐富度最高的為Allobaculum(22.57%)，其他草本群落間優(yōu)勢屬較為相似，而TC、LW、ND均以微小桿菌屬(Exiguobacterium)為主導(dǎo)屬，豐度分別為40.66%、20.26%和7.40%，CK以泛菌屬(Pantoea)、微小桿菌屬和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)為主。豐度聚類結(jié)果表明，在該地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的葉際微生物中，細(xì)菌中的大腸桿菌-志賀菌(Escherichia-Shigella)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、泛菌屬(Pantoea)、克雷伯氏菌屬、微小桿菌屬豐度較高且分布相似，為葉際細(xì)菌群落的主要類別。

2.2 洞庭湖濕地生態(tài)恢復(fù)過程中典型植物葉際真菌群落多樣性

2.2.1真菌群落α多樣性

CK、LW、ND、TC和YS這5個類群真菌測序獲得有效序列數(shù)量分別為94 090、65 577、127 167、88 037 和124 243條，處理后獲得的OTU數(shù)量分別為289、253、303、205和227條。ND群落OTU數(shù)量最多，其次是CK，TC群落最低。所有植物群落葉際真菌OTU共注釋到285屬544種，其中，CK獲得的注釋最多。不同植物群落葉際真菌多樣性比較見圖3，5個植物群落Chao1指數(shù)和物種豐富度差異不顯著；原生蘆葦與新生蘆葦葉際真菌多樣性無顯著差異；ND群落Shannon指數(shù)顯著高于其他4個群落，其譜系多樣性顯著高于LW、TC和YS群落。研究結(jié)果表明蘆葦葉際真菌群落較穩(wěn)定，受環(huán)境影響較小，新生ND群落多樣性較高；此外，YS葉際真菌多樣性低于ND，但與LW、CK和TC群落沒有差異。

YS、TC、LW、CK和ND分別為楊樹、苔草、新生蘆葦、原生蘆葦和南荻群落。圖2 葉際細(xì)菌群落的多樣性結(jié)構(gòu)Fig.2 Diversity structure of phyllosphere bacterial community

2.2.2真菌群落β多樣性與物種組成

不同群落間真菌β多樣性結(jié)果〔圖4(a)〕表明，CK與LW及其他草本群落無顯著差異，YS群落真菌β多樣性顯著低于TC和ND群落。PCA分析結(jié)果〔圖4(b)〕表明，前兩個軸共解釋總變量的57.54%，其中，PC1和PC2分別解釋總變量的32.28%和25.26%。從各群落的排序來看，每個群落的生物學(xué)重復(fù)相互聚集，表明重復(fù)性較好，且群落間差異明顯。從排序結(jié)果來看，CK、LW和TC葉際真菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，而與ND和YS差異較大；從PC1來看，YS與其他草本群落的組成差異較大。

真菌OTU注釋結(jié)果〔圖4(c)〕表明，葉際真菌相對豐度最大的是座囊菌綱(Dothideomycetes)，其在YS、TC、LW、CK、ND中的豐度分別為31.40%、40.98%、51.60%、44.38%和26.57%；其次是糞殼菌綱(Sordariomycetes)，其在各群落的相對豐度分別為9.97%、19.07%、13.26%、6.47%和8.56%。此外，由于葉際真菌注釋信息有限，可得到的物種類型相對很少，仍然存在較多未注釋到的物種。真菌屬級豐度熱圖〔圖2(d)〕表明，YS真菌組成與其他類群相比差異較大，其豐度最高的為柱隔孢屬(Ramularia，12.51%)，而TC、LW中鐮刀菌屬(Fusarium)豐度最高，分別為10.34%和7.63%，CK以隱球菌屬(Cryptococcus)豐度(2.85%)為最高，ND以枝孢菌(Saitozyma)豐度(22.06%)為最高；CK真菌組成與LW、TC和ND也有一定差異，其優(yōu)勢群落隱球菌屬、小球腔菌屬(Leptosphaeria)和黑酵母菌(Aureobasidium)豐度在其他草本群落中較低，表明新生的植物葉際真菌群落還在適應(yīng)環(huán)境。

A為物種豐富度，B為Chao1指數(shù)，C為Shannon指數(shù)，D為譜系多樣性指數(shù)。*表示在0.05水平上顯著，箱型圖從上沿到下沿分別表示數(shù)據(jù)的最大值、上四分位數(shù)、中位數(shù)、下四分位數(shù)和最小值。YS、TC、LW、CK和ND分別為楊樹、苔草、新生蘆葦、原生蘆葦和南荻群落。圖3 真菌多樣性指數(shù)箱型圖Fig.3 Box plot of fungus diversity index

豐度聚類結(jié)果表明，在該地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的葉際中，真菌中的鑲刀菌屬、青霉屬、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、Papiliotrema、枝頂孢屬(Acremonium)和彎孢屬(Curvularia)豐度較高且分布相似，是葉際真菌群落的主要類別。

2.3 植物群落間葉際微生物組成差異

Venn圖展示了不同植物群落葉際微生物群落共有或特有的OTU，展示了各植物群落間葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性、重疊情況及特異性(圖5)。由圖5可知，5個植物群落葉際細(xì)菌群落共有OTU數(shù)量為42，而YS、TC、LW、CK和ND葉際細(xì)菌群落特有的OTU數(shù)量分別為204、104、176、212和75； 5個葉際真菌群落共有OTU數(shù)量為105，而YS、TC、LW、CK和ND葉際真菌群落特有的OTU個數(shù)分別為179、37、75、112和113。5個群落葉際微生物群落中共有真菌種類高于細(xì)菌，YS和CK細(xì)菌及真菌的特有種數(shù)量較高，其中，CK細(xì)菌和真菌的特有種數(shù)量均高于LW，表明原生蘆葦和楊樹群落具有適應(yīng)性更強(qiáng)的特有微生物。

YS、TC、LW、CK和ND分別為楊樹、苔草、新生蘆葦、原生蘆葦和南荻群落。圖5 細(xì)菌和真菌OTU組成維恩圖Fig.5 Venn diagram of OTU composition of bacteria and fungi

不同植物群落葉際細(xì)菌和真菌群落的差異物種特征，對評價物種與葉際微生物多樣性的關(guān)系十分重要，Lefse分析常用于反映某個植物群落中具有顯著差異的微生物類別。不同植物群落的葉際細(xì)菌差異見圖6(a)，YS中鑒定到的有顯著差異的微生物種類有5屬8科3種；TC中鑒定到的有顯著差異的有8屬10科3種；ND有2屬4科1種；LW有5屬10科1種；CK有7屬8科，OTU中具有顯著差異的全部未注釋到物種。

不同植物群落的葉際真菌差異見圖6(b)，YS中鑒定到的有顯著差異的微生物種類有5屬5科7種；TC有3屬3科3種；ND有5屬6科6種；LW有4屬4科3種；CK有5屬7科8種。

3 討論

洞庭湖楊樹清理對該區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生較大影響，其中，最直觀的就是植物多樣性。劉靜逸等[27]研究發(fā)現(xiàn)，洞庭湖楊樹清理后，土壤種子庫萌發(fā)物種數(shù)、種子庫密度和物種多樣性指數(shù)顯著高于未清理的楊樹樣地，濕地恢復(fù)潛力增強(qiáng)；在自然恢復(fù)過程中楊樹清理跡地土壤酶活性顯著增強(qiáng)，土壤含水率和土壤氮、磷、鉀以及有機(jī)質(zhì)等含量較楊樹樣地明顯提高，為其他植物定植提供了條件；楊樹清理后，隨著水淹頻次的增加，一或二年生濕生物種迅速減少，蘆葦、南荻以及多年生物種所占比例增加，水文波動驅(qū)動了清理跡地的群落演替。隨著植物多樣性結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性也在變化。植物葉片棲息了大量細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、藻類等微生物群落，在某些情況下，還生活著線蟲和原生動物[28]。大量研究表明，目前已經(jīng)探明的葉際微生物種類只涵蓋了很少一部分，自然界仍存在大量未知葉際微生物，例如對巴西熱帶雨林不同物種葉際細(xì)菌群落的研究表明，97%的細(xì)菌序列來自未知物種，而能夠獲得注釋的物種數(shù)從95到671個不等[29]，自然界中存在大量未培養(yǎng)和未鑒定的微生物[30]。此次研究從5種植物類群中鑒定到的細(xì)菌和真菌OTU平均分別超過10萬個，但分別僅有56和544個為已知物種，表明在洞庭湖濕地葉際生態(tài)系統(tǒng)中仍存在大量未知微生物種類。

一般來說，葉際細(xì)菌中主要類群為好氧細(xì)菌類群，此次研究中主導(dǎo)細(xì)菌類群主要為兼性厭氧類群，如類芽孢桿菌屬、泛菌屬和克雷伯氏菌屬等，一方面這與濕地植物周期性水淹造成無氧環(huán)境有關(guān)；另一方面與葉際微生物來源有關(guān)，例如沉降、雨水濺射和土壤污染也會導(dǎo)致環(huán)境尤其是土壤中厭氧微生物遷移到葉片上[31]。筆者研究中植物群落葉際真菌主要為座囊菌綱(Dothideomycetes)和糞殼菌綱(Sordariomycetes)，與之前報(bào)道的水蔥(Schoenoplectustabernaemontani)、蘆葦?shù)葷竦刂参镆恢耓32-33]，其主導(dǎo)類別除了常見的短梗霉屬(Aureobasidium)、鑲刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)外[34]，還有彎孢屬(Curvularia)等，但目前普遍認(rèn)為上述類絲狀真菌通常以孢子形式存在，只是葉際中暫時的定居者。

葉際微生物生存環(huán)境十分惡劣，主要是由于葉際的理化條件較為特殊，例如，葉表環(huán)境溫濕度波動較大，紫外輻射較強(qiáng)，葉表面的營養(yǎng)物質(zhì)十分有限，再加上不同植物種類、不同發(fā)育階段的差異，導(dǎo)致葉際微生物為了適應(yīng)環(huán)境而演化出復(fù)雜的群落特征，并提供了寶貴的強(qiáng)耐受性基因資源[35]。

圖中由內(nèi)到外的圓形代表由界至種的分類級別，在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該分類水平下的一個物種，其直徑大小與相對豐度呈正比，黃色圓圈表示無顯著差異的類別。YS、TC、LW、CK和ND分別為楊樹、苔草、新生蘆葦、原生蘆葦和南荻群落。圖6 植物群落間葉際微生物組成差異分析Fig.6 Analysis on the difference of phyllosphere microbial composition between plant communities

筆者研究中，5個植物群落葉際微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，定殖的微生物群落也有較大差異，尤其是天然更新的楊樹群落的組成和多樣性與其他草本群落差異顯著，其原因可能是楊樹高度高于其他草本而導(dǎo)致其局部氣候的差異。同時，楊樹葉片的結(jié)構(gòu)，例如氣孔、葉表皮細(xì)胞、網(wǎng)狀脈等不同于其他草本植被。此外，原生蘆葦群落葉際無論是細(xì)菌還是真菌群落，雖然α多樣性與新生蘆葦及其他草本植物較為相近，但其在組成上確有較大差異。原生蘆葦群落的優(yōu)勢菌群與其他植物群落存在一定區(qū)別，并且原生蘆葦和楊樹群落都具有更多特異性微生物，這表明原生植物在定殖后逐漸改變多樣性結(jié)構(gòu)以適應(yīng)新的環(huán)境，因此，新生蘆葦與原生蘆葦群落葉際多樣性結(jié)構(gòu)差異較大。此外，不同植物群落間微生物與宿主之間存在不同的互作關(guān)系，例如，天然更新的楊樹和薹草葉際微生物中假單胞菌(Pseudomonasspp.)占比高于其他植物群落，而該屬細(xì)菌約一半的菌種能夠產(chǎn)生表面活性劑來增加葉面濕潤度，從而改變?nèi)~際水分利用環(huán)境[36]；在苔草和蘆葦(原生及次生)群落中發(fā)現(xiàn)了正固氮螺菌(Azospirillum)，該類菌屬能夠利用葉際產(chǎn)生的營養(yǎng)和能量發(fā)揮固氮作用[37]，從而促進(jìn)植物發(fā)育和生態(tài)系統(tǒng)的固氮功能。此外，甲基桿菌屬(Methylobacterium)作為葉際微生物中最常見的兼性甲基營養(yǎng)菌類，其代謝物通常具有抗植物病害的作用，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用較多[38]，筆者研究中所有植物葉際均發(fā)現(xiàn)該類細(xì)菌，但其在蘆葦中的豐度遠(yuǎn)高于其他植物〔圖6(a)〕，表明蘆葦可能具有更強(qiáng)的病蟲害抗性。

植物的環(huán)境、物理化學(xué)和遺傳特征決定了微生物生存和生長的能力[39]，并且人類的實(shí)踐活動對微生物的定殖也有很大影響[32]。對于洞庭湖楊樹清理跡地，人為干預(yù)后的人為/天然更新植物群落不僅提升了區(qū)域植物多樣性，而且增加了葉際微生物多樣性，這些額外定殖的微生物在某些方面提升了區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)功能，如固氮、抗病等，表明洞庭湖楊樹清理和跡地生態(tài)修復(fù)對于洞庭湖濕地生態(tài)系統(tǒng)功能的提升起到了促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

葉際微生物作為生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，具有不可忽視的生態(tài)功能。對洞庭湖楊樹清理跡地主要植物群落葉際微生物細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明，喬木楊樹葉際細(xì)菌多樣性最高，細(xì)菌和真菌多樣性組成與草本植物差異較大，且具有較多特異性微生物種類。草本群落間微生物多樣性結(jié)構(gòu)差異較大，且新生蘆葦群落與原生蘆葦群落葉際微生物也具有一定差異，表明葉際微生物群落在定殖過程中會改變多樣性結(jié)構(gòu)來適應(yīng)環(huán)境。研究表明區(qū)域植被群落的增加不僅提升了植被多樣性，而且提供了葉際環(huán)境的多樣性，從而為許多有益葉際微生物提供棲息地。該研究不僅分析了不同植物種類葉際微生物組成差異，也為探索洞庭湖楊樹清理跡地生態(tài)系統(tǒng)功能恢復(fù)提供了理論支撐。