青海省西寧地區(qū)綿羊住肉孢子蟲(chóng)感染情況調(diào)查研究

孟 茹，付 永，王淑琴，康 明，張成圖，吳 英，陳永忠，謝彩英

（1西寧市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，西寧 810003；2青海畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810003；3青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810000）

0 引言

住肉孢子蟲(chóng)(Sarcocystis)是一種人畜共患的傳染病[1-2]，屬于頂復(fù)門(mén)，孢子蟲(chóng)綱，真球蟲(chóng)目，住肉孢子蟲(chóng)科，住肉孢子蟲(chóng)屬，是專(zhuān)性寄生于細(xì)胞內(nèi)的原蟲(chóng)[3]。住肉孢子蟲(chóng)中間宿主多為食草動(dòng)物，終末宿主多為食肉動(dòng)物，羊是其重要的中間宿主[4]。綿羊住肉孢子蟲(chóng)病在世界分布廣泛[5]，寄生于綿羊的住肉孢子蟲(chóng)有4種，分 別 為 S.gigantea、 S.medusiformis、 S.tenella、S.arieticanis，前2種終末宿主是貓科動(dòng)物，后2種終末宿主是犬科動(dòng)物且均對(duì)羊有致病性。中國(guó)綿羊住肉孢子蟲(chóng)的平均陽(yáng)性率為41.5%，最低陽(yáng)性率為7.74%，而最高陽(yáng)性率為100%[6]。住肉孢子蟲(chóng)病不僅影響肉品質(zhì)量，而且嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康[7-8]。西寧市人口占全省人口的1/3，部分地區(qū)少數(shù)民族人口達(dá)到了80%以上[9]，食用肉類(lèi)主要以牛、羊肉為主。目前，已證實(shí)多種住肉孢子蟲(chóng)具有較強(qiáng)的致病性，主要表現(xiàn)在感染后可引起貧血、消瘦、乳產(chǎn)量下降、流產(chǎn)甚至死亡[10-11]，然而西寧地區(qū)住肉孢子蟲(chóng)系統(tǒng)的專(zhuān)項(xiàng)流調(diào)幾乎是空白，因此掌握西寧市及其轄屬區(qū)縣綿羊住肉孢子蟲(chóng)的感染強(qiáng)度并明確感染類(lèi)型可以為有效開(kāi)展住肉孢子蟲(chóng)病防控提供科學(xué)的技術(shù)支撐。

1843年Miescher第1次通過(guò)鏡檢在鼠橫紋肌中發(fā)現(xiàn)了白色線狀的住肉孢子蟲(chóng)包囊[12]，1990年王光雷[13]提出通過(guò)觀察住肉孢子蟲(chóng)囊壁的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其在中間宿主體內(nèi)的發(fā)育過(guò)程作為羊住肉孢子蟲(chóng)的蟲(chóng)種鑒定指標(biāo)，住肉孢子蟲(chóng)的研究不斷深入。目前，住肉孢子蟲(chóng)的診斷技術(shù)除經(jīng)典的組織壓片鏡檢外，胃蛋白酶消化技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)以及分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的研究也日益廣泛，但在肉品檢驗(yàn)中，組織壓片鏡檢耗時(shí)長(zhǎng)檢出率低，胃蛋白酶消化技術(shù)又常常會(huì)使肌細(xì)胞被過(guò)度消化，影響觀察，容易出現(xiàn)漏診[14]。分子生物學(xué)鑒定是目前確定感染蟲(chóng)種最可靠的方法，常用的候選基因有18SrRNA、28SrRNA和線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(cytochrome C oxidase subunit 1,Cox1)基因[15]。其中Cox1基因是線粒體基因組中比較保守基因，具有中度的變異速率，廣泛用于細(xì)胞和寄生蟲(chóng)種屬鑒別及交叉污染分析[16]，多項(xiàng)研究表明其適宜于種間的分類(lèi)鑒別和系統(tǒng)發(fā)育，近年來(lái)廣泛用于住肉孢子蟲(chóng)分類(lèi)研究[17]。目前針對(duì)西寧市轄屬區(qū)縣市場(chǎng)流通的羊肉各肌肉部位住肉孢子蟲(chóng)感染率、感染強(qiáng)度系統(tǒng)研究還很欠缺，因此，掌握西寧市市場(chǎng)流通中羊肉的住肉孢子蟲(chóng)感染情況，為牛羊肉調(diào)運(yùn)流通的關(guān)鍵地區(qū)提出防控住肉孢子蟲(chóng)病的有效措施，為西寧市的牛羊調(diào)運(yùn)及市場(chǎng)流通的牛羊肉檢驗(yàn)檢疫是否應(yīng)該加入關(guān)于住肉孢子蟲(chóng)病的檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)，都是目前西寧市動(dòng)物疫病防控特別是人畜共患病防控和保障市民購(gòu)買(mǎi)的畜產(chǎn)品質(zhì)量安全面臨和急需解決的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料

在西寧市的青海裕泰屠宰場(chǎng)、湟源縣的青海眾和肉食品有限公司隨機(jī)抽取供往西寧市轄屬區(qū)縣各市場(chǎng)、超市及攤販的屠宰后綿羊，分別采取剔除脂肪組織和結(jié)締組織后的膈肌、心肌、舌肌、食道肌樣品各40份，每份至少10 g，編號(hào)并標(biāo)明樣品來(lái)源及日期后裝于樣品袋中立即帶回西寧市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心病理室，-40℃冰箱保存。試驗(yàn)在西寧市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心病理實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，于2018年11月—2019年10月進(jìn)行。

乙醇溶液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20190403）、4%多聚甲醛通用型組織固定液（Biosharp，生產(chǎn)批號(hào)1608145）、二甲苯（萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠，生產(chǎn)批號(hào)20140518）、染色機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，型號(hào)YR-23）、包埋機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，型號(hào)YB-6LF）、切片機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，型號(hào)YGQ-3128D）、上海華連醫(yī)療器械有限公司電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)DHP-9082型）、奧林巴斯顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司，型號(hào)CX21）、顯微成像系統(tǒng)（奧林巴斯（日本）有限公司，型號(hào)Motic BA310）。

1.2 方法

1.2.1 壓片鏡檢 首先剝離肉樣表面肌膜、脂肪，肉眼觀察肌肉表面是否存在白色米粒狀或點(diǎn)狀疑似蟲(chóng)體存在。食道肌可直接觀察是否存在住肉孢子蟲(chóng)包囊，膈肌、心肌、舌肌剖開(kāi)表層肌肉順肌纖維方向剪取肉樣1 g，盡量不要剪的很碎，之后再將剪取的肌肉橫切剪至米粒大小，每塊載玻片放5～6小塊，用力將肉樣壓薄，呈半透明狀，以透過(guò)肉樣依然清晰可見(jiàn)報(bào)紙上的六號(hào)字為準(zhǔn)（見(jiàn)圖1）。在10×10倍光學(xué)顯微鏡下檢查計(jì)數(shù)，在任何一個(gè)部位發(fā)現(xiàn)住肉孢子蟲(chóng)包囊，即被判定為陽(yáng)性，并計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)住肉孢子蟲(chóng)感染率、感染強(qiáng)度，未檢出蟲(chóng)體者判定為陰性。

圖1 膈肌、舌肌、心肌壓片圖

1.2.2 切片制作及HE染色 剛?cè)〉男迈r組織塊經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，沖洗，經(jīng)不同濃度乙醇溶液脫水，二甲苯透明。經(jīng)透蠟后將組織連同熔化的石蠟，一起倒入盛有蒸餾水的容器內(nèi)，使其立刻凝固成蠟塊；調(diào)整石蠟切片與刀片的位置和角度進(jìn)行切片，厚度一般為4～7 μm，切片機(jī)搖轉(zhuǎn)速度40 rpm；將切片至37℃恒溫箱中烘干，用二甲苯脫蠟后經(jīng)酒精和蒸餾水沖洗，將切片放入蘇木精水溶液中染色，樹(shù)膠封片。

1.2.3 蟲(chóng)種的分子生物學(xué)鑒定 采用DNA提取試劑盒對(duì)感染樣本肉樣進(jìn)行消化、DNA提取。以Cox1的特異性片段為靶基因設(shè)計(jì)的引物，引物參照Rubiola S[14]上下游引物分別為F:5，-TGTACATACTTACGGCAGGT-3，R:5，-CCGTAGGTATGGCGATCA-3。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，其中模板DNA 2 μL，上、下游引物(100 nmol/μL)各 1 μL，10×PCR Master Mix 2.5 μL，BSA1 μL，滅菌去離子水18.5 μL。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 5 min；變性95℃ 60 s，退火60℃ 45 s，延伸72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；延伸72℃ 5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 西寧地區(qū)綿羊各部位肌肉感染情況分析

對(duì)隨機(jī)抽樣采取的供往西寧轄屬區(qū)縣的屠宰場(chǎng)、超市、集散中心和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的40只綿羊?qū)?yīng)的食道肌、膈肌、心肌、舌肌住肉孢子蟲(chóng)感染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，檢查出有33份樣品有住肉孢子蟲(chóng)感染，具體每份樣品不同部位的感染數(shù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。對(duì)此次樣品的整體感染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，此次整體樣品感染率為82.5%，其中膈肌的感染率為75%，心肌的感染率為67.5%，舌肌的感染率為57.5%，平均感染強(qiáng)度7.67，不同部位感染狀況詳見(jiàn)表2。膈肌、心肌、舌肌住肉孢子蟲(chóng)壓片鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖2～4，可以看出，10倍顯微鏡下觀察，住肉孢子蟲(chóng)蟲(chóng)體一般在為300～455 μm，呈長(zhǎng)梭形，分布于肌纖維中，與纖維方向平行，囊壁表面平。從寄生部位上看，膈肌感染率最高(75%)，其次是心肌(67.5%)、舌肌(57.5%)，食道肌未見(jiàn)有感染。

圖2 西寧地區(qū)綿羊膈肌住肉孢子蟲(chóng)10倍鏡壓片觀察結(jié)果

圖3 西寧地區(qū)綿羊心肌住肉孢子蟲(chóng)10倍鏡壓片觀察結(jié)果

圖4 西寧地區(qū)綿羊舌肌住肉孢子蟲(chóng)10倍鏡壓片觀察結(jié)果

表1 西寧地區(qū)綿羊不同部位肌肉感染數(shù)量統(tǒng)計(jì)

表2 西寧地區(qū)綿羊不同部位住肉孢子蟲(chóng)感染情況

續(xù)表1

2.2 染色切片鏡檢結(jié)果分析

對(duì)西寧地區(qū)綿羊膈肌、心肌住肉孢子蟲(chóng)切片進(jìn)行觀察，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6，經(jīng)H.E.染色可見(jiàn)蟲(chóng)體呈藍(lán)紫色，周?chē)∪饨M織呈紅色，蟲(chóng)體呈長(zhǎng)梭形，分布于肌肉纖維間，蟲(chóng)體囊壁分為兩層，原生囊壁與次生囊壁均結(jié)構(gòu)平整無(wú)突起皺褶等特殊性結(jié)構(gòu)，初步鑒定為綿羊柔嫩住肉孢子。

圖5 西寧地區(qū)綿羊膈肌住肉孢子蟲(chóng)染色切片結(jié)果

圖6 西寧地區(qū)綿羊心肌住肉孢子蟲(chóng)染色切片結(jié)果

2.3 分子生物學(xué)鑒定分析

選取蟲(chóng)體含量高的羊心肌和膈肌樣品，采用動(dòng)物基因組抽提試劑盒提取樣品DNA，經(jīng)COI-PCR法擴(kuò)增目的基因、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及分析后，成功擴(kuò)增出目的條帶，PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序，序列長(zhǎng)度為905 bp。在GenBank上進(jìn)行序列比對(duì)，Blast測(cè)序結(jié)果標(biāo)明其與已公布的羊柔嫩住肉孢子蟲(chóng)的同源性達(dá)98%，最終鑒定為綿羊柔嫩住肉孢子(S.tenella)，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

3 討論

3.1 西寧地區(qū)綿羊住肉孢子蟲(chóng)的感染強(qiáng)度分析

調(diào)查表明，河南地區(qū)綿羊住肉孢子蟲(chóng)的感染率為32.48%[18]，湛江羊感染率為70.68%[19]，西寧地區(qū)的感染強(qiáng)度要高于國(guó)內(nèi)其他省份。但是在青海省內(nèi)，青海澤庫(kù)縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的感染率在90%～100%之間[20]，互助縣綿羊住肉孢子蟲(chóng)病感染率為100%[21]，青?；】h[22]綿羊膈肌中住肉孢子蟲(chóng)的感染率為93.3%，數(shù)據(jù)顯示西寧地區(qū)綿羊住肉孢子蟲(chóng)的感染強(qiáng)度較青海省其他州縣感染整體偏低，特別是此次研究隨機(jī)采取的樣本中未見(jiàn)綿羊食道肌住肉孢子蟲(chóng)的感染。主要原因有3個(gè)方面，首先：可能是由于樣本采集面及采集數(shù)量有限。其次，與城市郊區(qū)生活飲食習(xí)慣及衛(wèi)生條件都較牧區(qū)有極大改善。最后，與西寧市近年非常重視養(yǎng)犬管理，相繼出臺(tái)《犬類(lèi)免疫技術(shù)規(guī)范》、《寵物診療機(jī)構(gòu)診療活動(dòng)技術(shù)規(guī)范》、《西寧市養(yǎng)犬管理?xiàng)l例》等對(duì)犬類(lèi)管理、免疫及診療等都進(jìn)行了規(guī)范化管理，對(duì)犬進(jìn)行建檔及定期驅(qū)蟲(chóng)，糞便嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)害化處理等舉措有關(guān)。關(guān)于不同部位的感染情況，相比蘇曉雪等[23]通過(guò)隨機(jī)采樣后鏡檢發(fā)現(xiàn)青海共和地區(qū)藏羊不同部位感染率由高到低依次為心肌(96.88%)、膈肌(87.50%)、食道肌(22.07%)，本次研究我們采集同一只羊屠宰后膈肌、心肌、舌肌、食道肌進(jìn)行檢測(cè)，更能反應(yīng)不同部位的真實(shí)感染情況。

3.2 西寧地區(qū)綿羊感染蟲(chóng)種分析

常用于住肉孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種鑒定的基因有Cox1基因、18S rRNA和28S rRNA基因[24-26]。研究表明，Cox1作為線粒體基因中的保守基因，在寄生蟲(chóng)的分類(lèi)鑒定和群體遺傳方面，被認(rèn)為是理想的遺傳標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于包括住肉孢子蟲(chóng)在內(nèi)的原蟲(chóng)的種類(lèi)鑒別及系統(tǒng)發(fā)育分析[27-28]。并且Cox1為靶基因的COI—PCR法要比以18S rRNA和28S rRNA為靶基因的SSU rRNA-PCR和LSU rRNA-PCR的特異性要好，可有效區(qū)分住肉孢子蟲(chóng)與其他寄生蟲(chóng)，適合于動(dòng)物源性食品中住肉孢子蟲(chóng)的篩查[29]。巨金玲等[30]用pcox1序列構(gòu)建巨型住肉孢子蟲(chóng)與其他住肉孢子蟲(chóng)的種群遺傳關(guān)系，謝彩英等[31]通過(guò)pcox1的PCR擴(kuò)增、測(cè)序與分析，發(fā)現(xiàn)共和縣藏羊心肌的住肉孢子蟲(chóng)存在2個(gè)種。本研究采用COI—PCR法在綿羊膈肌和心肌中擴(kuò)增cox1的特異性片段，測(cè)序后在GenBank上進(jìn)行序列比對(duì)，同源性與已公布的羊柔嫩住肉孢子蟲(chóng)的達(dá)98%，因此可以明確目前西寧地區(qū)綿羊感染主要以羊柔嫩住肉孢子蟲(chóng)(Sarcocystis tenella)為主。

3.3 西寧市地區(qū)住肉孢子蟲(chóng)病防治策略分析

住肉孢子蟲(chóng)病傳播主要由犬、貓等終末宿主引起[32]，通過(guò)接觸污染的食物或者飲水是人和家畜感染住肉孢子蟲(chóng)病的主要途徑，因此加強(qiáng)檢驗(yàn)檢疫和防治污染是控制此病的有效手段[33]，但是檢驗(yàn)檢疫主要是在農(nóng)牧防疫、檢疫等有關(guān)部門(mén)開(kāi)展，同時(shí)由于住肉孢子蟲(chóng)病感染后對(duì)人的傷害較包蟲(chóng)病、布魯氏菌病等人畜共患病較弱，在養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)的宣傳力度也相對(duì)薄弱，公眾對(duì)其相關(guān)知識(shí)普及率低，特別是牧區(qū)等相對(duì)落后地區(qū)，農(nóng)牧民更是知之甚少，因此未來(lái)防控應(yīng)考慮農(nóng)牧、衛(wèi)生、執(zhí)法等部門(mén)聯(lián)防聯(lián)控，同時(shí)加強(qiáng)科普宣傳力度，利用新聞媒體、農(nóng)牧服務(wù)平臺(tái)及公眾號(hào)等各種渠道，使廣大農(nóng)牧民和市民提高認(rèn)識(shí)，以達(dá)群防群控的目的。傳統(tǒng)治療該病主要采用伊維菌素、吡喹酮等，目前尚無(wú)針對(duì)性的疫苗和特效治療藥物[34]，未來(lái)住肉孢子蟲(chóng)的有效防治還需加大科研和推廣示范力度，篩選可用于免疫和治療的候選基因并開(kāi)展有效藥物實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)西寧地區(qū)羊住肉孢子蟲(chóng)病感染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)西寧地區(qū)綿羊肉住肉孢子蟲(chóng)感染率為82.5%，平均感染強(qiáng)度7.67，從寄生部位上看，膈肌感染率最高75%，感染率已經(jīng)遠(yuǎn)高于中國(guó)平均水平，因此相關(guān)部門(mén)急需引起高度重視，考慮制定專(zhuān)項(xiàng)防治計(jì)劃，并納入本地區(qū)疫病防控體系中。此外本研究通過(guò)對(duì)Cox1保守區(qū)片段擴(kuò)增、測(cè)序、比對(duì)初步明確西寧地區(qū)綿羊感染主要以羊柔嫩住肉孢子蟲(chóng)為主，為西寧地區(qū)評(píng)估羊住肉孢子蟲(chóng)病的危害及采取有效防控措施提供了重要科學(xué)依據(jù)，并且該方法省時(shí)、敏感、特異、準(zhǔn)確，可考慮進(jìn)一步優(yōu)化和完善用于住肉孢子蟲(chóng)病的分子診斷和流行病學(xué)調(diào)查。