沙棘轉(zhuǎn)錄因子HrWRKY53基因分離及其參與抵御繞實蠅的作用分析*

姚 瑩 曹金峰 陸世曈 丁文彬 張一文 魏建榮 劉建鳳

(1.河北大學生命科學學院 河北大學生命科學與綠色發(fā)展研究院 保定 071002； 2.河北省農(nóng)作物耐鹽堿評價與遺傳改良重點實驗室 滄州市農(nóng)林科學院 滄州 061001)

沙棘(Hippophaerhamnoides)果實味酸，又稱醋柳、酸刺，屬胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(Hippophae)，是1種落葉性灌木或小喬木，廣泛分布于亞歐大陸的溫帶、寒溫帶地區(qū)以及亞熱帶高山區(qū)，北美地區(qū)也有引種栽培(Tengetal.， 2006)。我國的沙棘植物資源十分豐富，遍及西南、西北、華北和東北等區(qū)域，其已成為我國“三北”地區(qū)造林綠化與經(jīng)濟的主要樹種之一，種植面積較大，但蟲害嚴重威脅著沙棘種植與推廣。目前，沙棘害蟲有多種，涵蓋了鱗翅目、鞘翅目、半翅目和雙翅目等多種食葉與食果昆蟲。其中，雙翅目中沙棘繞實蠅(Rhagoletisbatavaobseuriosa)(RBO)是危害沙棘果實的首要害蟲(Shamanskayaetal.， 2011)。迄今為止，該科已發(fā)現(xiàn)約500屬、4 500余種，其中有害實蠅種類占35%左右，廣泛分布于世界各地(汪興鑒， 1995)。沙棘繞實蠅成蟲產(chǎn)卵于果皮下，幼蟲蛀食果肉，常致受害果實干癟，是國家林業(yè)和草原局發(fā)布的國內(nèi)檢疫害蟲之一(魏建榮等， 2012)。1985年在國內(nèi)遼寧省建平縣首次發(fā)現(xiàn)沙棘繞實蠅的危害現(xiàn)象，其果實受害率達80%以上(葛葆蔚等， 1988)。近年來在內(nèi)蒙古烏蘭布和沙漠地區(qū)和新疆阿勒泰地區(qū)的沙棘林中也出現(xiàn)沙棘繞實蠅，且危害嚴重，說明該蟲害有擴大趨勢。目前，種植沙棘地區(qū)對繞實蠅危害的防治主要是依靠噴施化學農(nóng)藥，該方法可有效的降低害蟲存活率及其繁殖率，但會出現(xiàn)環(huán)境污染等生態(tài)問題，不利于可持續(xù)性發(fā)展。因此，開發(fā)環(huán)保、高效、可持續(xù)發(fā)展的防治方式是目前沙棘產(chǎn)業(yè)的待解決問題，也是重要的研究方向之一。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族部分成員可通過參與茉莉酸(Jasmonic acid，JA)、水楊酸(Salicylic acid，SA)和油菜素內(nèi)酯(Brassinolide，BR)等信號途徑來提高植株的抗病蟲能力(Stametal.， 2014)。如水稻OsWRKY24/70/53/45基因通過影響乙烯信號途徑來參與調(diào)控抗褐飛虱(Nilaparvatalugens)反應(Luetal.， 2014； Zhangetal.， 2015； Huetal.， 2015)； 棉花(Gossypiumspp.)WRKY40基因可以通過調(diào)控MPK-WRKY-茉莉酸信號通路，來提高植株對白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)的抗性(Lietal.， 2016)； 對大豆(Glycinemax)WRKY基因家族鑒定與分析時發(fā)現(xiàn)其部分成員受SA信號通路誘導后提高了植株抗大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)的能力(Yangetal.， 2017)；AtWRKY40轉(zhuǎn)錄因子可通過與下游靶基因DWF4基因上游調(diào)控元件結(jié)合，進而調(diào)控BR合成參與抗蟲過程(Chenetal.， 2017)； Hou等(2019)鑒定和證實了WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員WRKY72直接與JA合成關(guān)鍵基因AOS1啟動子中的W-box順式元件結(jié)合，增強AOS1的DNA甲基化水平并抑制其轉(zhuǎn)錄，引起植株內(nèi)源性JA水平的下降，最終造成植株對白葉枯病易感。由此可見，WRKY家族成員通過激活相關(guān)信號途徑廣泛參與植株抗病蟲的應答反應。

綜上，有關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子抗蟲分子生物學研究多集中在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、棉花和大豆等模式植物和經(jīng)濟作物中，而在其他植物尤其是在木本植物中鮮見報道。鑒于此，本研究基于繞實蠅危害前后的沙棘果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得48個沙棘HrWRKY基因家族成員(Wangetal.， 2019)，其中部分成員參與了繞實蠅危害的應激反應，尤其是HrWRKY53轉(zhuǎn)錄因子在受到繞實蠅危害及JA激素誘導后表達極為顯著，本研究結(jié)果為進一步明確沙棘HrWRKY53轉(zhuǎn)錄因子的生物學功能及介導JA激素信號通路參與抗蟲的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 沙棘植株獲取

2～3年生沙棘扦插苗取材于河北大學實驗基地。該基地沙棘原始植株取自于中國林業(yè)科學研究院沙漠林業(yè)實驗中心(內(nèi)蒙古磴口縣)(40°25.935′N，106°43.442′E)，由蒙古沙棘的實生無性系烏蘭格木(Hippophaerhamnoidessubsp.mongolica)(母本)與中國沙棘(Hippophaerhamnoidessubsp.sinensis)(父本)雜交獲得的F2代無性系材料。

1.2 沙棘HrWRKY53轉(zhuǎn)錄因子克隆及生物信息學分析

沙棘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)： 基于繞實蠅危害前后沙棘果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(PRJNA507906)，分析抗、感沙棘植株體內(nèi)WRKYs和JA信號通路上關(guān)鍵基因的序列特征及表達情況。

HrWRKY53轉(zhuǎn)錄因子克?。?初步獲得HrWRKY53基因ORF電子全長序列1 301 bp。利用Trizol法提取沙棘幼苗葉片總RNA，利用TaKaRa 610A反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。PCR反應體系為： cDNA模板1 μL，DNA聚合酶0.1 μL，10×Buffer 1.0 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.8 μL，10 mmol·L-1的基因特異性引物F與R各0.5 μL(F： GCAACAGCAGA TGAAACACC； R： CCTAGGATATTGCCCTTGACC)，ddH2O補至10 μL體系。PCR反應程序為： 95 ℃變性5 min、95 ℃變性30 s、58 ℃退火45 s、72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，利用TaKaRa膠回收試劑盒(Code No.9762)純化回收目的條帶； 將回收的目的片段與TaKaRa pGM-T Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，PCR鑒定的陽性克隆進行測序。

HrWRKY53轉(zhuǎn)錄因子生物信息學分析： 使用SOPMA分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)； 使用ProtScale(http:∥web.expasy.org/protscale)預測蛋白的親疏水性； 使用NetPhos2.0 Server(http:∥www.cbs.dtu. dk/services/NetPhos-2.0/)預測蛋白的磷酸化位點； 通過NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中BLASTP搜索與該基因同源性較高的序列，并利用MEGAX中鄰近法構(gòu)建進化樹，bootstrap值設(shè)置為1 000； 利用DNAMANV6進行多重序列比對。

1.3 沙棘HrWRKY53的組織表達模式分析

為了研究HrWRKY53的組織表達模式，選取沙棘植株的根、莖、葉片和果實等組織，利用寶生物工程(大連)有限公司的植物總RNA提取試劑盒RNAiso Kit(D326 S)提取上述樣品沙棘果實的總RNA，并采用UEIris II RT-PCR system for First-Strand cDNA Synthesis(with dsDNase)試劑盒(R2028，US EverbrightInc.)，以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以沙棘泛素基因(HrUbi)為內(nèi)參基因，使用熒光定量PCR試劑盒2×Fast Super EvaGreen?qPCR Master Mix進行HrWRKYs的基因表達量分析，引物序列信息如表1。qRT-PCR反應程序為： 95 ℃預變性5 min； (94 ℃ 20 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s)×35循環(huán)，95→65 ℃熔解曲線(0.1 ℃·s-1)。各組織3次生物學重復，使用相對定量法2-ΔΔCt進行數(shù)據(jù)分析，采用獨立樣本t檢驗方法比較目的基因在敏感系植株和抗蟲系植株的表達差異。

表1 沙棘HrWRKY53及JA合成途徑中關(guān)鍵基因熒光定量引物序列Tab.1 The fluorescent quantitative primer for genes

1.4 繞實蠅危害及激素誘導后HrWRKY53基因表達分析

采用枝條罩籠接蟲法對沙棘植株果實進行RBO處理，分別選取沙棘成果期植株3株，并分別在其上各選取3個2年生且直徑約0.5 cm粗的幼嫩結(jié)果的枝條，對其進行疏果處理，確保果實數(shù)量、形態(tài)和大小基本一致。利用養(yǎng)蟲籠(50 cm×50 cm×100 cm)分別對上述枝條進行罩籠(盡量使RBO接觸果實)，各引入30頭待產(chǎn)卵沙棘繞實蠅雌成蟲讓其產(chǎn)卵危害，并分別在罩籠0、2、7、14、21天采取受害果實，立即浸入液氮，用于HrWRKY53基因的熒光定量表達。

對株高約1.2～1.5 m的沙棘植株的果實分別噴施0.1 mmol·L-1MeJA、0.1 mmol·L-1ABA和0.1 mmol·L-1ETH，并選取處理0、4、8、16和36 h的植株地上部10、70和140 cm各3片葉片混合，液氮冷凍后-80 ℃保存。各時間點3次生物學重復，使用相對定量法2-ΔΔCt進行數(shù)據(jù)分析，采用獨立樣本t檢驗方法比較目的基因在敏感系植株和抗蟲系植株的表達差異。

上述樣品的RNA提取與熒光定量PCR均參照1.3描述的方法。

1.5 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)均采用Origen 7.5軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著性比較采用t檢驗法。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)篩選參與沙棘抗繞實蠅的HrWRKYs轉(zhuǎn)錄因子家族成員

通過繞實蠅危害前后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，獲得8個差異表達的HrWRKYs基因成員HrWRKY1/17/18/53/33/40/41/71，其中，HrWRKY53的表達水平在抗、感之間表現(xiàn)顯著性差異(表2)。鑒于此，對轉(zhuǎn)錄因子HrWRKY53開展了后續(xù)分子生物學功能驗證。

表2 沙棘關(guān)鍵HrWRKYs差異基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達量分析Tab.2 Transcriptome data analysis of key HrWRKYs differential genes in sea-buckthorn

2.2 沙棘HrWRKY53生物信息學分析

提取沙棘幼苗葉片RNA，并利用RT-PCR獲得與預期ORF框大小一致的長為1 302 bp的HrWRKY53基因，編碼433個氨基酸殘基，預測蛋白分子量49.26 kD，等電點5.55。SOPMA預測表明，HrWRKY53蛋白的二級結(jié)構(gòu)α螺旋(alpha helix)包含38個氨基酸殘基，占8.78%； 延伸鏈(extened strand)的氨基酸殘基有41個，占9.47%； β-轉(zhuǎn)角(beta turn)包含10個氨基酸殘基，占2.31%； 無規(guī)則卷曲(Random coil)包含433個氨基酸殘基，占79.45%(圖1A)，推測該蛋白的功能域主要由無規(guī)則卷曲構(gòu)成。HrWRKY53蛋白含高于0.5閾值的有141個磷酸化位點(圖1B)，可能與磷酸化調(diào)控有密切關(guān)系。親疏水性分析顯示，疏水蛋白所占比例較大，屬于疏水蛋白(圖1C)。

圖1 HrWRKY53編碼蛋白的生物信息學分析Fig. 1 Bioinformatic analysis of HrWRKY53A、B、C分別是二級結(jié)構(gòu)預測、磷酸化位點預測和親疏水性分析(正峰代表疏水性，負峰代表親水性)。 A, B and C are the secondary structure prediction, phosphorylation site prediction and hydrophobicity analysis (positive peak value represents hydrophobicity, negative peak value represents hydrophilicity).

2.3 沙棘HrWRKY53同源比對及進化分析

利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫，選取多條相似度較高物種的WRKY蛋白與沙棘HrWRKY53蛋白進行同源比對，結(jié)果顯示目的蛋白有2個WRKY保守域，且鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2，屬于第Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子(圖2A)。進一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，其與薔薇科草莓FvWRKY25同源關(guān)系最近(圖2B)。

圖2 HrWRKY53轉(zhuǎn)錄因子蛋白同源進化分析Fig. 2 Homologous evolutionary analysis of HrWRKY53 transcription factor proteins A、B分別是HrWRKY53與其他物種WRKY蛋白序列比對分析和不同WRKY蛋白的進化樹分析。方框表示W(wǎng)RKY結(jié)構(gòu)域，星號表示鋅指結(jié)構(gòu)。沙棘HrWRKY53，野大豆GsWRKY24，大豆GmWRKY49，木豆CcWRKY24，大豆GmWRKY39，紅小豆VaWRKY25，綠豆VrWRKY24，豇豆VuWRKY24，榴蓮DzWRKY24，白櫟QiWRKY24，野草莓FvWRKY25，烏草HuWRKY24，可可樹TcWRYK33，麻風樹JcWRYK24，月季RcWRYK24，棉花GhWRYK9，麻風樹JcWRKY7，木槿HsWRKY26，蓮NnWRKY24，雷公藤TwWRKY26，大桉EgWRKY26，灌木蒲桃SoWRKY26，狹葉羽扇豆LaWRKY2，鷹嘴豆CaWRKY26。A and B are sequence alignment of HrWRKY53 and WRKY proteins of other species and phylogenetic analysis of different WRKY proteins.The box indicates the WRKY domain, and the star indicates the zinc finger structure. Hippophae rhamnoides HrWRKY53, Glycine soja GsWRKY24, Glycine max GmWRKY49, Cajanus cajan CcWRKY24, Glycine max GmWRKY39, Vigna angularis VaWRKY25, Vigna radiata VrWRKY24, Vigna unguiculata VuWRKY24, Durio zibethinus DzWRKY24, Quercus lobata QiWRKY24, Fragaria vesca FvWRKY25, Herrania umbratica HuWRKY24, Theobroma cacao TcWRYK33, Jatropha curcas JcWRYK24, Rosa chinensis RcWRYK24, Gossypium hirsutum GhWRYK9, Jatropha curcas JcWRKY7, Hibiscus syriacus HsWRKY26, Nelumbo nucifera NnWRKY24, Tripterygium wilfordii TwWRKY26, Eucalyptus grandis EgWRKY26, Syzygium oleosum SoWRKY26, Lupinus angustifolius LaWRKY24, Cicer arietinum CaWRKY26.

2.4 沙棘HrWRKY53組織表達分析

利用qRT-PCR分析沙棘莖、葉和果實不同組織HrWRKY53基因的表達模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述組織中該基因均有表達，但在抗蟲植株的各組織中表達量顯著高于敏感植株，尤其在抗蟲植株的果實和葉片中該基因表達量顯著提高，其表達量約為敏感植株3.36倍和1.66倍(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)錄因子HrWRKY53在沙棘不同組織中的表達Fig. 3 Expression of transcription factor HRWRKY53 in different tissues of sea-buckthornRI： 抗蟲無性系； SI： 敏感無性系； *和**： 在P<0.05和P<0.01時差異表達顯著性和極顯著性水平,下同。RI： Insect-resistant clones; SI： Sensitive clones * and **: Significant differences and extremely significant differences at 0.05 level and 0.01 level,the same below.

2.5 繞實蠅危害及激素誘導后沙棘HrWRKY53表達分析

qRT-PCR結(jié)果表明，該基因在沙棘植株受繞實蠅危害后表達提高，并受激素ET、MeJA和SA的誘導。在繞實蠅危害后不同時間，發(fā)現(xiàn)該基因無論是在抗性植株還是感性植株中表達量均呈上升趨勢，尤其抗性植株中其表達量較感性植株提高了0.2～1.4倍(圖4A)； SA處理16 h內(nèi)，基因的表達變化趨勢不明顯，但處理36 h時抗性植株內(nèi)基因表達量急劇上升，較對照上升了6.14倍，且較感性植株高出了1.87倍(圖4B)，隨著MeJA和ET處理時間的延長，該基因的表達量也呈上升趨勢，在36 h達到最高峰，尤其是MeJA誘導后，該基因在抗性植株較對照植株表達提高了43.8倍，且較感性植株高出了1.63倍(圖4C和圖4D)。

圖4 不同處理下HrWRKY53的表達模式Fig. 4 Expression patterns of HrWRKY53 under different treatments A、B、C、D分別為RBO、SA、JA和ET脅迫下HrWRKY53基因的表達模式分析。A, B, C and D are the expression patterns of HrWRKY53 gene under RBO, SA, JA and ET stress.

2.6 明確了沙棘植株體內(nèi)JA激素合成相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達變化

JA合成途徑中關(guān)鍵基因HrJA2、HrSpr2、HrLOX1、HrLOX2、HrAOS和HrAOC在抗、感植株體內(nèi)及繞實蠅危害前后植株體內(nèi)均有一定變化，其中HrJA2、HrLOX1、HrAOS和HrAOC4個基因在繞實蠅危害抗性植株前后均呈明顯的上調(diào)趨勢(表3)，結(jié)果表明在繞實蠅危害后JA信號通路上的HrJA2、HrLOX1、HrAOS和HrAOC這4個基因可能被激活。進而我們對受到繞實蠅危害的抗性植株中4個基因的表達情況進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在檢測的基因中HrJA2基因上調(diào)表達達到極顯著水平，12 h表達量約為0 h的11倍左右(圖5)。

表3 基于繞實蠅危害前后沙棘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)JA合成途徑中關(guān)鍵基因的表達量分析①Tab.3 The expression levels of key genes in the JA synthesis pathway of seabuckthorn were analyzed based on transcriptome data under RBO

圖5 繞實蠅危害后沙棘植株內(nèi)茉莉酸信號途徑中關(guān)鍵基因表達量Fig. 5 Expression levels of key genes in JA signaling pathway in the resistant plants under RBOA、B、C、D分別為RBO脅迫下HrJA2、HrLOX1、HrAOS和HrAOC基因的表達模式分析。A, B, C and D are the expression patterns of HrJA2, HrLOX1, HrAOS and HrAOC genes under RBO stress.

3 討論

隨著轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學和蛋白質(zhì)組學等多種組學及分子生物學方法的快速發(fā)展，目前已對植物轉(zhuǎn)錄因子家族在生物脅迫等方面的生物學功能開展了大量研究，并在不同水平的分子調(diào)控機制上取得了顯著成果。然而，關(guān)于沙棘HrWRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員調(diào)控沙棘抗繞實蠅危害的具體分子機制還鮮見報道。本研究基于實驗室前期沙棘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及定量分析結(jié)果，挖掘并分析了沙棘HrWRKY53轉(zhuǎn)錄因子的分子序列特征，并通過RBO及相關(guān)激素處理后，對沙棘抗蟲植株及敏感植株的HrWRKY53基因表達量進行了分析，探討了HrWRKY53調(diào)控沙棘抗繞實蠅過程中的作用機制，為進一步研究沙棘WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的抗蟲機制提供重要思路與線索。

3.1 HrWRKY53基因的結(jié)構(gòu)及組織表達特異性

本研究基于沙棘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及熒光定量分析篩選獲得1條與抗蟲相關(guān)的差異表達的基因HrWRKY53，序列分析發(fā)現(xiàn)目的基因包含1 302 bp的開放閱讀框，編碼433個氨基酸，與其他WRKY蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)該基因有2個WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域，鋅指蛋白為C2H2型，證明該基因?qū)儆诘?類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。其WRKY結(jié)構(gòu)域含有4個β折疊，并有由1對半胱氨酸殘基(Cys)與1對組氨酸(His)殘基組成的鋅離子結(jié)合功能結(jié)構(gòu)，能與目標基因啟動子中的順式作用元件W-box(TTGAC序列)特異結(jié)合，從而調(diào)節(jié)目標基因的表達，其調(diào)控基因表達主要受病原菌、蟲咬、機械損傷、外界脅迫壓力和信號分子的誘導(文鋒等， 2017)。有研究表明，C端的WRKY結(jié)構(gòu)域在第Ⅰ類WRKY與DNA結(jié)合過程中起主導作用，而N端WRKY結(jié)構(gòu)域的功能目前還不清楚，可能與WRKY轉(zhuǎn)錄因子與DNA特異序列的親和力和結(jié)合特異性有關(guān)，通過提高其親和力和特異性從而參與該家族轉(zhuǎn)錄因子與DNA相互結(jié)合的過程(Eulgemetal.， 1999； Maeoetal.， 2001)。

不同脅迫處理后，HrWRKY53基因在沙棘各組織中的表達情況顯示，沙棘的葉片、果實和莖中均有表達且產(chǎn)生不同程度的改變。有研究發(fā)現(xiàn)，枸杞LbWRKY3在根中表達量最高，在花中表達量最低(徐惠娟等， 2016)； 丹參(Salviamiltiorrhiza)絕大多數(shù)WRKY基因也在根中呈現(xiàn)優(yōu)勢表達，總表達量較其他組織高(Lietal.， 2015)； 甜菜(Betavulgaris)WRKY基因在植物各組織中表達差異較大，WRKY總表達量在根中最高，在葉中表達量最低，大多數(shù)基因在根中優(yōu)勢表達(孔維龍等， 2017)。在繞實蠅危害后，HrWRKY53明顯能被誘導表達，且在各個組織中均為上調(diào)表達，尤其是抗蟲植株的果實和葉片表達量變化最為顯著?？赡苁怯捎谏臣@實蠅在對沙棘果實危害時，會對果實造成一定的機械損傷及病原菌殘留，從而誘導該基因的表達，根據(jù)繞實蠅的取食情況等原因，故導致不同組織的表達量情況有所差異。

3.2 HrWRKY53基因的表達分析

已有研究表明，植物被細菌、真菌等及其激發(fā)子感染后，體內(nèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平及DNA結(jié)合活性都會顯著提高，并且WRKY轉(zhuǎn)錄因子對抗病相關(guān)基因表達起著重要的調(diào)節(jié)作用(Eulgemetal.， 2007； Pandeyetal.， 2009)。如水稻中WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族部分成員介導ET信號通路抗褐飛虱(Luetal.， 2014； Zhangetal.， 2015； Huetal.， 2015)； 菊花(Macrosiphoniellasanborni)中CmWRKY53調(diào)節(jié)菊花的次生代謝產(chǎn)物達到抗蚜蟲的目的(Zhangetal.， 2020)； 棉花WRKY40介導JA信號通路提高棉花對白粉虱的抗性(Lietal.， 2016)； 擬南芥WRKY40介導BR參與其抗蟲(Chenetal.， 2017)。基于本實驗室前期繞實蠅危害前后沙棘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得8個差異表達的HrWRKYs轉(zhuǎn)錄因子家族成員，進一步篩選發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子HrWRKY53的表達水平在抗、感之間表現(xiàn)出顯著差異。因此，筆者推測HrWRKY53具有抗蟲功能并研究比較了沙棘抗蟲植株和敏感植株在繞實蠅危害前后及激素誘導后HrWRKY53的表達情況。結(jié)果顯示，該基因在抗蟲植株的果實和葉片中上調(diào)極為顯著。

植物激素在其生長發(fā)育及對逆境脅迫的響應方面有著很重要的作用(Barietal.， 2009)，它可以由外界的環(huán)境脅迫誘導產(chǎn)生，在植物體內(nèi)往往以低水平調(diào)節(jié)各種生理反應。此前有研究發(fā)現(xiàn)，植物對昆蟲口腔或產(chǎn)卵分泌物中特異性激發(fā)子的識別會激活植物體內(nèi)多種植物激素信號途徑，包括茉莉酸、水楊酸、脫落酸、乙烯、赤霉素等，這些信號途徑進一步激活防御基因的表達及直接防御和間接防御化合物的產(chǎn)生，使植物表現(xiàn)出抗蟲性(Howeetal.， 2008； Wuetal.， 2010； Erbetal.， 2012)。茉莉酸甲酯作為植物體內(nèi)1種常見信號物質(zhì)，在植物遭受病蟲害損害時，會誘導植物產(chǎn)生揮發(fā)物來趨避害蟲，從而減輕對植物的危害(徐偉等， 2010)。在研究過程中發(fā)現(xiàn)HrWRKY53基因在MeJA誘導下表達量顯著升高，表明HrWRKY53基因表達可能可受到JA激素誘導來響應繞實蠅危害。筆者進一步發(fā)現(xiàn)繞實蠅危害后JA信號通路關(guān)鍵基因HrJA2表達水平顯著上升。綜上，本研究表明沙棘受到繞實蠅危害后，JA合成通路關(guān)鍵基因HrJA2表達量會顯著上升，導致JA含量升高，從而誘導轉(zhuǎn)錄因子HrWRKY53的表達，提高沙棘植株的抗蟲性。

4 結(jié)論

本研究基于沙棘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得了參與沙棘抗繞實蠅危害的HrWRKY53轉(zhuǎn)錄因子基因，其開放閱讀框為1 302 bp，編碼433個氨基酸。HrWRKY53基因所編碼的氨基酸序列與薔薇科草莓FvWRKY25氨基酸序列同源性最高，具有2個保守的WRKY結(jié)構(gòu)，屬于WRKY基因家族I類。該基因的表達具有組織特異性，其在沙棘果實中表達量最高； 同時不同激素處理后，HrWRKY53基因的表達均有一定變化，但對茉莉酸甲酯誘導響應更敏感，且繞實蠅危害后JA信號通路關(guān)鍵基因HrJA2表達量顯著升高。本研究結(jié)果為沙棘抗蟲分子機制的研究提供新的思路與視角，同時也為沙棘等胡頹子科植物的抗蟲分子育種提供科學依據(jù)與基因資源。