女貞葉、莖、根及根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及功能群特征*

李 斌 史鴻翔 劉蘭蘭 楊 璞 張 欣 陳 航 馮 穎 陳曉鳴

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所 昆明 650224； 2.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院 昆明 650224)

早期的陸生植物通過(guò)與原始的叢枝菌根真菌(AM)建立互惠共生關(guān)系，到后期松科植物與外生菌根真菌(EcM)形成穩(wěn)定的共生組合，植物與真菌共生增強(qiáng)了植物從土壤中獲取養(yǎng)分的能力，促進(jìn)了植物向新生態(tài)位的擴(kuò)張和陸地生態(tài)系統(tǒng)的演化(Martinetal.， 2017)。

植物內(nèi)生真菌和根際土壤真菌作為植物微生物群(microbiota)的主要組成部分，也是自然界真菌多樣性的主要來(lái)源之一(Porras-Alfaroetal.， 2011)。真菌與植物共生是植物進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力之一，二者在長(zhǎng)期的演化歷程中形成了密切的互作關(guān)系，大量研究表明，植物相關(guān)的真菌群落在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)植物健康中發(fā)揮著重要作用，并能賦予宿主植物在生物(病原菌、植食性昆蟲(chóng))和非生物(干旱、鹽堿、重金屬等)脅迫下的適合度優(yōu)勢(shì)(Yanetal.， 2019； Trivedietal.， 2020)。此外，植物內(nèi)生真菌還能合成多種次生代謝產(chǎn)物(如生物堿、萜類、聚酮類、醌類、甾體等)，這些天然產(chǎn)物具有生物細(xì)胞活性，可用于生產(chǎn)抗腫瘤、抗感染藥物(Lietal.， 2018)。因此，植物內(nèi)生真菌和根際真菌在生物肥料、生防藥劑、困難和污染立地生物修復(fù)、臨床藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有巨大的開(kāi)發(fā)利用潛力。

女貞(Ligustrumlucidum)屬木犀科(Oleaceae)，是一種在我國(guó)分布廣泛的園林樹(shù)木和藥用植物(女貞子)，也是資源昆蟲(chóng)白蠟蟲(chóng)(Ericeruspela)的優(yōu)良寄主植物(陳曉鳴， 2011； 劉美紅等， 2020)，具有抗寒耐旱、吸滯塵埃、凈化空氣、吸附重金屬等優(yōu)良特性(程敏等， 2010； Wangetal.， 2015； Zhouetal.， 2018)，在造林綠化、環(huán)境污染生物修復(fù)和蟲(chóng)白蠟生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。

我國(guó)約有8 000多種樹(shù)木，每種樹(shù)木都蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源。前期對(duì)紅豆杉類、紅樹(shù)類、楊樹(shù)(Populus)、銀杏(Ginkgobiloba)、松科植物等少數(shù)樹(shù)木微生物組的研究引起了學(xué)界對(duì)林木微生物組的廣泛關(guān)注(王志偉等， 2014； 袁志林等， 2019)。近年來(lái)，隨著2代和3代測(cè)序技術(shù)(Illumina、PacBio等)和生物信息學(xué)分析方法的發(fā)展和進(jìn)步，基于rRNA ITS(Internal Transcribed Spacer)基因的高通量擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于林木相關(guān)真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的研究中(曹紅雨等， 2019； 王顏波等， 2020)。當(dāng)前，對(duì)女貞-真菌互作的研究主要集中于叢枝菌根真菌對(duì)女貞鹽脅迫、重金屬脅迫耐受性的影響(張愛(ài)娣等， 2018； 何錚， 2020)，鮮見(jiàn)關(guān)于女貞內(nèi)生真菌、根際土壤真菌群落研究的報(bào)道?；谂懙闹匾獌r(jià)值和植物相關(guān)真菌群落的諸多功能及其利用潛力，系統(tǒng)解析健康植株背景下女貞不同器官和根際土壤相關(guān)的真菌類群和群落結(jié)構(gòu)，旨在為研究女貞微生態(tài)平衡維持機(jī)制和開(kāi)發(fā)生防、促生和抗逆功能菌株奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

平頂山女貞人工純林(25°04′N，102°48′E，海拔2 190 m)地處云南省昆明市東北郊，屬亞熱帶高原山地季風(fēng)氣候，林區(qū)土壤為山地紅壤(取樣土壤pH為4.76 ± 0.01，相對(duì)濕度=25.64% ± 0.17%)， 2020年7月降雨量為282.6 mm，平均氣溫19.8 ℃。

1.2 樣品采集與表面無(wú)菌化處理

7月，研究區(qū)域降雨充沛，女貞進(jìn)入生長(zhǎng)發(fā)育最旺盛的時(shí)期。在女貞林區(qū)內(nèi)間隔30 m，標(biāo)記3株5年生、無(wú)病蟲(chóng)害且株型相似的女貞單株[株高(2.14 ± 0.13) m，地徑(8.65 ± 0.54 cm)]，分別采集葉(LE)、莖(1年生)(SE)、根(RE)和根際土壤(RS)(每株4個(gè)樣本，3個(gè)重復(fù)，共12個(gè)樣本)，根際土壤取根圍距根表0.5～4 mm的薄層土壤(Kuzyakovetal.， 2019)，過(guò)10目(2 mm)無(wú)菌篩后干冰保存。葉、莖、根放入無(wú)菌自封袋并暫存于4 ℃冰盒內(nèi)，4 h內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，參照Cregger等(2018)的方法完成葉、莖、根的表面滅菌處理，液氮速凍，無(wú)菌超低溫研磨后-80 ℃保存。經(jīng)PDA培養(yǎng)基涂板檢測(cè)表面無(wú)菌后，繼續(xù)開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)(謝憲等， 2020)。

1.3 樣本DNA的提取與擴(kuò)增測(cè)序

采用土壤、植物通用試劑盒FastDNA?SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals)于無(wú)菌條件下提取各樣本DNA(Bollmann-Giolaietal.， 2020)，樣本DNA經(jīng)電泳檢測(cè)，濃度和純度質(zhì)檢合格后，使用真菌rRNA基因ITS1區(qū)擴(kuò)增引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTA GAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTT CATCGATGC-3′)(Adamsetal.， 2013)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用TaKaRa rTaq DNA Polymerase， 20 μL反應(yīng)體系，每樣本3次重復(fù)。擴(kuò)增程序如下： 95 ℃預(yù)變性3 min，35個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后4 ℃保存(PCR儀： ABI GeneAmp? 9700型)。經(jīng)檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物，使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit(Bioo Scientific，USA)進(jìn)行建庫(kù)，基于Illumina Miseq PE300平臺(tái)完成測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)已共享至NCBI Sequence Read Archive(SRA)數(shù)據(jù)庫(kù)(BioProject： PRJNA730395)。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

參照微生物擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)處理分析流程(Liuetal.， 2021)，基于生物云平臺(tái)(https:∥cloud.majorbio.com)(上海美吉)，Raw reads經(jīng)fastp(v0.19.6)過(guò)濾質(zhì)控和FLASH(v1.2.11)拼接后，使用UPARSE(v7.0.1090)將有效序列聚類為OTU(Operational taxonomic units)(聚類相似度≥97%)(Chenetal.， 2018； Magoetal.， 2011； Edgar， 2013)。使用RDP classifier(v2.11)和真菌ITS數(shù)據(jù)庫(kù)UNITE(v8.0)對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類注釋(Wangetal.， 2007； Nilssonetal.， 2019)。各樣本按序列數(shù)51 937抽平后，在OTU水平上，使用Mothur(v1.30.2)軟件(Hollisteretal.， 2009)計(jì)算α多樣性指數(shù)，并對(duì)各指數(shù)進(jìn)行Student’st檢驗(yàn)； 基于OTU表和物種分類學(xué)表，利用R(v3.3.1)工具進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和可視化，通過(guò)Venn分析、群落柱形圖(門(mén)、綱水平)和群落Heatmap圖(屬水平)比較不同樣品真菌組成情況； OTU1454和OTU1252序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，挑選近緣物種，并使用MEGA(v11.0)軟件，采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)； 基于樣本真菌群落間的Weighted normalized Unifrac距離，利用主坐標(biāo)分析(PCoA)和相似性分析(ANOSIM)，評(píng)價(jià)樣本差異對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響(β多樣性)； 接著利用LEfSe(linear discriminant analysis effect size)軟件(LDA閾值>4，多組比較策略All-against-all)確定4種樣品中存在顯著差異的真菌biomarkers(Segataetal.， 2011)； 最后，基于FUNGuild(v1.0)數(shù)據(jù)庫(kù)(Nguyenetal.， 2016)并參照謝憲等(2020)的方法對(duì)不同樣品真菌功能群進(jìn)行分類和統(tǒng)計(jì)，采用Cytoscape繪圖，Adobe Illustrator CC 2018優(yōu)化后輸出(僅展示預(yù)測(cè)可信度為“極可能”和“很可能”且相對(duì)豐度大于1%的真菌屬)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及α多樣性

4種樣品的12個(gè)樣本ITS測(cè)序共獲得757 906條原始序列，質(zhì)控后共獲得749 855條有效序列，序列平均長(zhǎng)度為235 bp，LE、SE、RE和RS各樣本的平均有效序列數(shù)分別為60 527、60 331、61 330和67 764條(表1)。按97%的序列相似性水平，將真菌序列歸類為1 486個(gè)OTU，經(jīng)注釋后主要分布于4個(gè)門(mén)，10個(gè)綱，18個(gè)目，33科，38屬。所有OTU中，能注釋到屬級(jí)水平的OTU數(shù)占OTU總數(shù)的44.75%，其相對(duì)豐度之和為81.37%。4種樣品測(cè)序文庫(kù)的平均覆蓋率(Coverage指數(shù))均大于99.7%，說(shuō)明測(cè)序深度足夠，用于樣本真菌群落生物信息學(xué)分析的測(cè)序數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

葉、莖、根和根際土壤真菌豐富度指數(shù)(Chao1和Ace)和多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson)如表1所示(OTU水平)，RS的Chao1指數(shù)最大，為900.90，其次為SE、RE和LE，分別為283.55、191.91和142.36，RS的Chao1指數(shù)顯著高于其他3組(P<0.05)，分別為SE、RE和LE的3.17、4.69和6.32倍； Ace指數(shù)與Chao1指數(shù)類似，即4種樣品的真菌豐富度為RS>SE>RE>LE。此外，RS的Shannon指數(shù)為3.89，顯著高于其他3組樣品，而Simpson指數(shù)在4組樣品間的差異不顯著。由此可知，女貞葉、莖、根和根際土壤的真菌豐富度排序?yàn)楦H土壤>莖>根>葉，而多樣性為根際土壤>葉>莖>根。

表1 不同樣品測(cè)序信息及α多樣性指數(shù)①Tab.1 Sequencing information and Alpha diversity index in different samples

2.2 不同樣品中的共有OTU和真菌屬

4種樣品中，LE、SE、RE和RS各樣品真菌群落的OTU數(shù)分別為241、397、386和1 081，分別占OTU總數(shù)的16.22%、26.72%、25.97%和72.74%。對(duì)4種樣品的真菌組成進(jìn)行OTU Venn圖分析(圖1A)發(fā)現(xiàn)，4種樣品中共有的OTU有31個(gè)，僅占OTU總數(shù)的2.08%，其相對(duì)豐度之和為38.44%。2組樣品比較中，RE和RS共有的OTU數(shù)最多，為297個(gè)，其次為L(zhǎng)E和SE、SE和RS、LE和RS，分別為158、140和95個(gè)，即葉、莖、根中39.42%、35.26%、76.94%的OTU都存在于根際土壤中； 然而，LE和RE、SE和RE共有的OTU數(shù)相對(duì)較少，分別為42和43個(gè)。

4種樣品共有的OTU中，能注釋到屬級(jí)水平的有22個(gè)，其相對(duì)豐度之和為33.46%。這些真菌屬主要包括：枝孢屬(Cladosporium)、維希尼克氏酵母屬(Vishniacozyma)、Saitozyma、Rachicladosporium、Symmetrospora、鏈格孢屬(Alternaria)、青霉菌屬(Penicillium)、短梗霉屬(Aureobasidium)、尾孢屬(Cercospora)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)、宙斯沸耳屬(Dioszegia)、鐮刀菌屬(Fusarium)等，其中，枝孢屬相對(duì)占比最高，占共有物種總數(shù)的33.62%(圖1B)。

圖1 4種樣品真菌群落OTU韋恩圖(A)和共有屬(B)Fig. 1 OTUs Venn diagram (A) and common genera (B) of fungal communities of four samples圖B中不同顏色表示不同的物種，面積表示該物種數(shù)目占共有物種總數(shù)的百分比。LE、SE、RE和RS分別表示葉內(nèi)、莖內(nèi)、根內(nèi)和根際土壤，下同。Different colors in the Fig.B represented different species, and its area represented the percentage of a given species in the total number of common species. The LE, SE, RE and RS represented leaf endosphere, stem endosphere, root endosphere and rhizosphere soil respectively, the same below.

2.3 不同樣品中的真菌優(yōu)勢(shì)類群組成分析

在門(mén)水平，女貞葉、莖、根和根際土壤樣品真菌主要?dú)w屬于子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、羅茲壺菌門(mén)(Rozellomycota)和被孢霉門(mén)(Mortierellomycota)(圖2A)。在LE、SE、RE和RS中，子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度分別為74.12%、72.63%、78.70%和39.25%； 擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度分別為25.35%、27.08%、19.87%和45.20%； 羅茲菌門(mén)和被孢霉門(mén)只分布于根內(nèi)和根際土壤中，且相對(duì)豐度較低(圖2A)。由此可見(jiàn)，子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)是女貞葉、莖、根和根際土壤中的優(yōu)勢(shì)真菌類群。

在綱水平上(圖2B)，座囊菌綱(Dothideomycetes)為L(zhǎng)E和SE中的優(yōu)勢(shì)真菌綱，相對(duì)豐度分別為67.09%和70.22%，但在RE(1.8%)和RS(3.38%)中的相對(duì)豐度較低； 銀耳綱(Tremellomycetes)在SE(22.78%)中的相對(duì)豐度最高，其次為RS(16.61%)、LE(14.91)和RE(1.18%)； RE中相對(duì)豐度最高的為糞殼菌綱(Sordariomycetes)(46.59%)，其次為錘舌菌綱(Leotiomycetes)(27.05%)和傘菌綱(Agaricomycetes)(11.60%)； RS中的優(yōu)勢(shì)真菌綱為傘菌綱(36.80%)。此外，散囊菌綱(Eurotiomycetes)在4種樣品中均有分布，但在RS(11.50%)中的相對(duì)豐度最高； 囊擔(dān)子菌綱(Cystobasidiomycetes)主要分布于LE(9.12%)和SE(2.48%)中； 而盤(pán)菌綱(Pezizomycetes)主要分布于RE(5.30%)和RS(5.97%)中； 古根菌綱(Archaeorhizomycetes)(7.53%)、被孢霉綱(Mortierellomycetes)(3.94%)則主要分布于RS中。

圖2 4種樣品中真菌在門(mén)(A)、綱(B)和屬(C)水平上的相對(duì)豐度Fig. 2 The relative abundance of fungi in four samples at phylum (A), class (B) and genus (C) level在圖A和圖B中，“其他”表示所有相對(duì)豐度小于1%的真菌類群的總和。在圖C中，色塊顏色表示真菌相對(duì)豐度的對(duì)數(shù)值(lg)。In figure A and figure B, the “others” represented the sum of fungal taxa with relative abundance of less than 1%. In figure C, the colors represented the logarithms of relative abundance of fungi.

在屬級(jí)水平(圖2C)，4種樣品豐度排名前30的物種中，LE中相對(duì)豐度較高的屬有枝孢屬(27.88%)、亞隔孢殼屬(Didymella)(12.21%)、維希尼克氏酵母屬(9.05%)、Symmetrospora(8.40%)、橫斷孢屬(Strelitziana)(5.99%)、尾孢屬(4.40%)和鏈格孢屬(4.27%)； SE中相對(duì)豐度較高的屬有枝孢屬(38.01%)、維希尼克氏酵母屬(15.24%)、Rachicladosporium(11.86%)、鏈格孢屬(3.93%)、短梗霉屬(Aureobasidium)(2.78%)、橫斷孢屬(2.02%)； RE中相對(duì)豐度較高的屬有Rhexodenticula(12.61%)、普可尼亞屬(Pochonia)(11.12%)、梭鏈孢屬(Fusidium)(11.09%)、樹(shù)粉孢屬(Oidiodendron)(10.74%)、Acidomelania(8.04%)和擬無(wú)疣革菌屬(Athelopsis)(5.70%)； 而RS中相對(duì)豐度較高的屬有裸蓋菇屬(Psilocybe)(33.59%)、Saitozyma(15.92%)、青霉菌屬(Penicillium)(6.35%)、努氏盤(pán)菌屬(Ruhlandiella)(5.88%)、古根菌屬(Archaeorhizomyces)(4.56%)和被孢霉屬(Mortierella)(3.94%)。由此可見(jiàn)，枝孢屬、維希尼克氏酵母屬、亞隔孢殼屬、Rachicladosporium、Symmetrospora、鏈格孢屬主要分布于葉和莖中，而裸蓋菇屬、Saitozyma、樹(shù)粉孢屬、Rhexodenticula、梭鏈孢屬、普可尼亞屬、努氏盤(pán)菌屬、Acidomelania、青霉菌屬等主要分布于根和根際土壤中。此外，樣本聚類分析顯示(圖2C)，LE和SE聚為一支，RE和RS聚為一支，表明在屬水平上，女貞葉和莖，根和根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)較為相似。

2.4 枝孢屬真菌OTU系統(tǒng)發(fā)育分析

OTU1454和OTU1252在葉、莖、根及根際土壤樣品中的序列總數(shù)分別為106 263和11 696，且注釋為枝孢屬。系統(tǒng)發(fā)育分析表明(圖3)，OTU1454與Cladosporiumsp.和枝狀枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)的親緣關(guān)系較近，而OTU1252與Cladosporiumlangeronii，Cladosporiumpsychrotolerans，Cladosporiumneolangeronii的親緣關(guān)系較近。

圖3 基于rDNA ITS1序列構(gòu)建OTU1454和OTU1252的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(Neighbor-joining算法)Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic trees based on rDNA ITS1 sequences of OTU1454 and OTU1252

2.5 β多樣性分析

基于OTU水平，對(duì)4種樣品的12個(gè)樣本進(jìn)行PCoA分析，比較不同樣本真菌群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異性(圖4)，結(jié)果顯示，PC1軸和PC2軸的貢獻(xiàn)率分別為55.5%和24.04%，累積貢獻(xiàn)率為79.54%； 并且LE與SE樣本點(diǎn)間的距離較為接近，二者與RE和RS的距離相對(duì)較遠(yuǎn)，表明女貞地上部分葉和莖內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)較為相似，而與地下部分根和根際土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)存在差異。

圖4 不同樣本真菌群落主坐標(biāo)分析Fig. 4 PCoA of fungal communities in different samples

此外，通過(guò)非參數(shù)檢驗(yàn)方法-相似性分析(ANOSIM)評(píng)估不同樣品真菌群落結(jié)構(gòu)在組間及組內(nèi)的差異水平(表中，R值越大，P值越小，表明組間差異越顯著)。由表2可見(jiàn)，4組樣品LE vs SE vs RE vs RS的ANOSIM分析結(jié)果中，R值為0.898 1，且P值為0.001，表明4種樣品真菌群落結(jié)構(gòu)的組間差異顯著大于組內(nèi)差異，3組比較的結(jié)果與之類似。然而，在兩兩比較分析中，除了LE vs SE和RE vs RS的R值分別為0.777 8和0.814 8外，其余均為1，且P> 0.05，表明兩兩樣品間的組間差異大于組內(nèi)差異，但不顯著，且LE和SE、RE和RS間的真菌群落組成差異相對(duì)較小，這與PcoA分析的結(jié)果相一致。

2.6 不同樣品LEfSe物種差異判別分析

由以上分析可知，女貞葉、莖、根和根際土壤為微生物群落提供了不同的棲息地，進(jìn)而導(dǎo)致不同的群落結(jié)構(gòu)(beta多樣性)差異。基于LEfSe分析可尋找女貞4組樣品真菌群落中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種，并識(shí)別葉、莖、根和根際土壤中的生物標(biāo)記物(biomarker)(圖5)。由分析結(jié)果可知，女貞4種生態(tài)位真菌群落在門(mén)水平上無(wú)顯著差異。在綱水平上，囊擔(dān)子菌綱顯著富集于葉中，座囊菌綱顯著富集于莖中，錘舌菌綱和糞殼菌綱顯著富集于根內(nèi)，傘菌綱顯著富集于根際土壤中。在屬水平上，葉中的biomarker為Symmetrospora、線黑粉酵母屬、尾孢屬、亞隔孢殼屬和橫斷孢屬； 莖中的biomarker為枝孢屬、維希尼克氏酵母屬、Rachicladosporium和短梗霉屬； 根中的biomarker為枝芽瓶霉屬(Cladophialophora)和鐮刀菌屬； 根際土壤中的biomarker為Saitozyma、擬盤(pán)多毛孢屬和青霉菌屬。

圖5 不同樣品LEfSe差異物種分析Fig. 5 LEfSe analysis of differential species in different samples圖中紅、藍(lán)、綠和紫色的節(jié)點(diǎn)分別表示在LE、SE、RE和RS中顯著富集，且對(duì)組間差異存在顯著影響的真菌類群，黃色節(jié)點(diǎn)表示在不同分組中無(wú)顯著差異或?qū)M間差異無(wú)顯著影響的真菌類群； 圖中C、O、F和G分別表示綱、目、科和屬。The red, blue, green and purple nodes in the figure represented fungal taxa that were significantly enriched in LE, SE, RE and RS respectively, and significantly influenced the differences between groups at the same time. The yellow nodes represented fungal taxa that have no significant differences among different groups, or that had no significant effect on the differences between groups. The C, O, F and G represented class, order, family and genus, respectively.

2.7 不同樣品真菌功能群比較分析

基于FUNGuild的功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明(圖6)，共生營(yíng)養(yǎng)型真菌在RE和RS中占比相對(duì)較高，分別為25.07%和10.91%，主要包括杜鵑花類菌根真菌(樹(shù)粉孢屬)、外生菌根真菌(努氏盤(pán)菌屬)和內(nèi)生真菌(Acidomelania)； 腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌則主要分布于RE(34.98%)和RS(56.60%)中，主要由未定義腐生真菌(裸蓋菇屬、梭鏈孢屬、擬無(wú)疣革菌屬、青霉菌屬)和土壤腐生真菌(古根菌屬)組成； 病理營(yíng)養(yǎng)型在RE(15.76%)中的相對(duì)豐度最高(主要為動(dòng)物病原菌普可尼亞屬)，其次為L(zhǎng)E(6.87%)(主要為植物病原菌橫斷孢屬)。此外，LE與SE中病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型、病理-腐生-共生營(yíng)養(yǎng)型真菌的相對(duì)豐度較高，病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌主要有亞隔孢殼屬、尾孢屬； 病理-腐生-共生營(yíng)養(yǎng)型真菌主要包括枝孢屬、維希尼克氏酵母屬、Rachicladosporium等。由此可見(jiàn)，女貞不同器官和根際真菌功能群分類呈現(xiàn)地上和地下部分分化的特征，葉和莖中的真菌以復(fù)合營(yíng)養(yǎng)型(病理-腐生-共生營(yíng)養(yǎng)型、病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型)真菌為主，分別占葉和莖真菌功能群的76.97%和91.68%； 然而，女貞根和根際土壤中的真菌以單一營(yíng)養(yǎng)型(腐生營(yíng)養(yǎng)型、共生營(yíng)養(yǎng)型)為主，分別占60.05%和67.51%(圖6)。

圖6 葉、莖、根、根際土壤真菌功能群組成及網(wǎng)絡(luò)分布Fig. 6 Functional group composition and network of fungi in leaf, stem, root and rhizosphere soil不同顏色代表不同的真菌營(yíng)養(yǎng)型或Guilds，扇形面積表示不同營(yíng)養(yǎng)型在各樣品中的相對(duì)豐度，節(jié)點(diǎn)大小表示某一真菌屬在所有樣品中的絕對(duì)豐度，節(jié)點(diǎn)與樣品連線的粗細(xì)表示該真菌屬在對(duì)應(yīng)樣品中的相對(duì)豐度。Different colors represent different fungal trophic types or Guilds, the pie diagram area indicates the relative abundance of different trophic types in each sample, the size of nodes indicates the absolute abundance of a genus in all samples, the thickness of links indicates the relative abundance of the genera.

3 討論

3.1 女貞葉、莖、根、根際土壤真菌多樣性和物種組成

植物相關(guān)微生物群的遺傳、生態(tài)、功能及分類多樣性與植物生長(zhǎng)和土壤健康密切相關(guān)(Saleemetal.， 2019)，生態(tài)漂變、選擇、進(jìn)化和擴(kuò)散作用可影響植物微生物群的組成和多樣性(Fitzpatricketal.， 2020)。本研究發(fā)現(xiàn)，女貞根際土壤真菌多樣性顯著高于葉、莖和根，這與美洲黑楊(Populusdeltoides)(Creggeretal.， 2018)、葡萄(Vitisvinifera)(Zarraonaindiaetal.， 2015)的結(jié)果相似?；谀壳暗难芯繑?shù)據(jù)表明，根際微生物群向根內(nèi)過(guò)渡的過(guò)濾選擇機(jī)制導(dǎo)致多樣性降低的現(xiàn)象在植物中普遍存在(Fonseca-Garcíaetal.， 2016； Hassanietal.， 2019)，然而構(gòu)樹(shù)(Broussonetiapapyrifera)根內(nèi)和根際真菌多樣性無(wú)顯著差異，并認(rèn)為與真菌對(duì)植物內(nèi)環(huán)境具有較高的耐受性相關(guān)(Chenetal.， 2020)。此外，女貞根內(nèi)真菌多樣性較低可能與富集較高豐度的病理營(yíng)養(yǎng)型真菌有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)病原菌的存在會(huì)抑制菌根真菌、內(nèi)生真菌的定殖，進(jìn)而降低內(nèi)生真菌的多樣性(Creggeretal.， 2018)。女貞葉內(nèi)真菌豐富度較低的原因可能是其暴露于多變嚴(yán)苛的環(huán)境條件下(如溫度、水分、養(yǎng)分的晝夜波動(dòng)、紫外線輻射、營(yíng)養(yǎng)匱乏)所致(Vorholt， 2012)。

不同植物擁有其獨(dú)特的微生物群落。研究發(fā)現(xiàn)，植物相關(guān)微生物群功能冗余特性背后存在一個(gè)“核心微生物群”(Core microbiota)，其作為植物微生物群的子集，攜帶對(duì)宿主健康至關(guān)重要的基因(Lemanceauetal.， 2017)?；陧f恩圖分析發(fā)現(xiàn)，女貞核心真菌類群主要包括枝孢屬、維希尼克氏酵母屬、Saitozyma、Rachicladosporium、Symmetrospora、鏈格孢屬、青霉菌屬等，且豐度較高的枝孢屬(OTU1454、OTU1252)真菌在不同女貞植株中的分布較均勻。系統(tǒng)發(fā)育分析表明OTU1454與枝狀枝孢霉的親緣關(guān)系較近，研究發(fā)現(xiàn)，耐鹽植物堿蓬(Suaedasalsa)內(nèi)生枝狀枝孢霉具有林木廣譜共生菌特性，可顯著提高宿主的種子發(fā)芽率和促進(jìn)非宿主植物北美楓香(Liquidambarstyraciflua)幼苗的生長(zhǎng)，且可從土壤水平傳播到植物地上部分(Qinetal.， 2016)。此外，OTU1252與C.langeronii的親緣關(guān)系較近，且有研究發(fā)現(xiàn)C.langeronii可使白蠟蟲(chóng)感病致死(Sunetal.， 2018)。此外，女貞葉與莖內(nèi)枝孢屬、鏈格孢屬、亞隔孢殼屬真菌的相對(duì)豐度較高，已有研究表明，這些植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤細(xì)胞活性(Lietal.， 2018；Ariantarietal.， 2020)和抗菌活性(Sunetal.， 2013；Mousaetal.， 2015)，這些真菌的存在可能與女貞的藥用價(jià)值有關(guān)(陳安徽等，2014)。

Beta多樣性分析表明，女貞不同葉、莖根和根際土的真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，同一器官菌群結(jié)構(gòu)在不同植株間差異較小，表明植物區(qū)室(Plant compartment)特性是影響女貞真菌群落生態(tài)位分化的主要驅(qū)動(dòng)因子，這種微生物群落組成的“植物區(qū)室特異性”(Plant compartment-specific)在植物中普遍存在(Coleman-Derretal.， 2015； Chenetal.， 2020)。然而，有研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物是植物內(nèi)生菌的主要來(lái)源之一(Vandenkoornhuyseetal.， 2015)，本研究中，葉、莖、根內(nèi)39.42%、35.26%、76.94%的OTU都存在于根際土壤中，表明土壤真菌可能是植物內(nèi)生真菌的主要來(lái)源之一，且女貞葉、莖、根和根際土真菌群落結(jié)構(gòu)存在部分重疊。此外，相比較而言，葉與莖的真菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，二者不僅通過(guò)氣孔、皮孔與相同的外部環(huán)境相關(guān)聯(lián)，而且還通過(guò)內(nèi)部輸導(dǎo)組織相連通，研究表明，植物地上組織中的內(nèi)生真菌可通過(guò)孢子或菌絲裂殖等方式進(jìn)行水平傳播(Rodriguezetal.， 2009； Yanetal.， 2019)。值得注意的是，宿主(基因型、形態(tài)特征、免疫反應(yīng)、根系分泌物等)和環(huán)境因子(生物和非生物脅迫、栽培管理、多界相互作用等)的改變可驅(qū)動(dòng)植物相關(guān)微生物群的重新組裝(Trivedietal.， 2020)。因此，女貞不同器官和根際土的真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性在不同地理區(qū)域、不同季節(jié)、不同發(fā)育階段內(nèi)的時(shí)空動(dòng)態(tài)還有待進(jìn)一步研究。

3.2 女貞葉、莖、根、根際土壤真菌生態(tài)功能特征

植物相關(guān)真菌在植物中發(fā)揮著有利、中性或有害的作用(Trivedietal.， 2020)。本研究中，女貞不同部位真菌功能群分類呈現(xiàn)地上和地下部分分化的特征，葉和莖中的真菌以復(fù)合營(yíng)養(yǎng)型(病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型、病理-腐生-共生營(yíng)養(yǎng)型)真菌為主，而根和根際土壤真菌以單一營(yíng)養(yǎng)型(共生營(yíng)養(yǎng)型、腐生營(yíng)養(yǎng)型)為主。研究發(fā)現(xiàn)，植物地下微生物主要在促進(jìn)養(yǎng)分獲取(礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的同化、溶解、轉(zhuǎn)運(yùn)等)中發(fā)揮作用，而地上部分微生物則在提高植物抗逆性(抗病蟲(chóng)害、抗干旱、霜凍等)方面發(fā)揮作用(Yanetal.， 2019； Trivedietal.， 2020)。本研究中，女貞生長(zhǎng)在降水充沛的酸性土壤條件下，淋溶作用強(qiáng)，其通過(guò)在根部富集高豐度的腐生、共生營(yíng)養(yǎng)型真菌，可促進(jìn)女貞對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的活化、吸收和利用(Philippotetal.， 2013)，滿足自身生長(zhǎng)發(fā)育的養(yǎng)分需求。此外，葉與莖內(nèi)復(fù)合營(yíng)養(yǎng)型真菌(枝孢屬、維希尼克氏酵母屬、鏈格孢屬、亞隔孢殼屬)豐度較高，研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌的生活方式具有可塑性，在宿主生理、遺傳因素、真菌病毒及環(huán)境條件等影響下會(huì)發(fā)生偏利共生、互惠共生和寄生間的角色轉(zhuǎn)變(袁志林等， 2008； Zhouetal.， 2021)，健康女貞中共存多種營(yíng)養(yǎng)型真菌，進(jìn)一步支持了植物“共生功能體”(holobiont)和諧共生的拮抗平衡假說(shuō)(Schulzetal.， 1999； Vandenkoornhuyseetal.， 2015)。

4 結(jié)論

女貞不同營(yíng)養(yǎng)器官(葉、莖、根)和根際土壤中存在多種藥用、促生及抗逆真菌資源，4種樣品中共獲得1 486個(gè)OTU，注釋后主要分布于4個(gè)門(mén)，10個(gè)綱，18個(gè)目，33科和38屬。葉、莖、根和根際土真菌多樣性、群落結(jié)構(gòu)及功能群特征存在相似性和差異性，根際土壤的真菌多樣性顯著高于葉、莖和根，葉與莖的群落結(jié)構(gòu)和物種組成較為相似，與根和根際土壤差異較大。在門(mén)水平上，葉、莖、根和根際土的優(yōu)勢(shì)真菌均為子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)； 在屬級(jí)水平上，葉、莖內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬為枝孢屬和維希尼克氏酵母屬，根內(nèi)優(yōu)勢(shì)屬為Rhexodenticula和普可尼亞屬，根際土壤的優(yōu)勢(shì)屬為裸蓋菇屬和Saitozyma。葉、莖、根及根際土壤共有的真菌主要包括枝孢屬、維希尼克氏酵母屬、Saitozyma、Rachicladosporium、Symmetrospora、鏈格孢屬及青霉菌屬。不同部位真菌功能群分類呈現(xiàn)地上和地下部分分化的特征，葉和莖中復(fù)合營(yíng)養(yǎng)型(病理-腐生-共生營(yíng)養(yǎng)型、病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型)真菌相對(duì)豐度較高，而根和根際土壤中單一營(yíng)養(yǎng)型(共生營(yíng)養(yǎng)型、腐生營(yíng)養(yǎng)型)真菌占比較高。