巨桉金屬耐受蛋白EgMTP6的分子特征及功能*

韓麗娜 謝賢安 陳 輝 唐 明

(嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院 廣州 510642)

鋅(Zn)作為生物的必需元素，是大量酶和調(diào)節(jié)蛋白中的催化或結(jié)構(gòu)輔助因子(Maret, 2009)。但鋅過(guò)量積累不僅造成植物中毒，生長(zhǎng)受抑制(Barceletal., 1990)，還可導(dǎo)致植株根部缺乏磷營(yíng)養(yǎng)(Dingetal., 2021)。為了維持體內(nèi)鋅平衡，植物在細(xì)胞水平上構(gòu)建了包括吸收、外排、螯合、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存鋅的網(wǎng)絡(luò)，如陽(yáng)離子擴(kuò)散輔助蛋白家族(cation diffusion facilitator, CDF)，根據(jù)結(jié)構(gòu)特異性和轉(zhuǎn)運(yùn)底物的種類，分為Zn-CDF、Zn/Fe-CDF和Mn-CDF 3個(gè)二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類群(Montaninietal., 2007)。植物CDF又稱為金屬耐受蛋白(metal tolerance protein, MTP)，基于擬南芥(Arabidopsisthaliana)12個(gè)MTP基因的分類，植物MTP分為7個(gè)組(Gustinetal., 2011)。

MTP作為膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可將重金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞器儲(chǔ)存或外排至胞外，從而影響植物對(duì)重金屬的耐受性(Gustinetal., 2011)。擬南芥中AtMTP1突變后對(duì)鋅敏感(Kobaeetal., 2004)，過(guò)表達(dá)AtMTP3增強(qiáng)植株對(duì)鋅的耐受性(Arrivaultetal., 2006)，過(guò)表達(dá)水稻(Oryzasativa)OsMTP1的酵母對(duì)鋅的耐受性增強(qiáng)(Yuanetal., 2012)。不同重金屬處理時(shí)，香橙(Citrussinensis)部分MTP表達(dá)量發(fā)生變化(Fuetal., 2017)。在不同組織和不同生長(zhǎng)時(shí)期，葡萄(Vitisvinifera)MTP差異表達(dá)(Shirazietal., 2019)。MTP在草本植物中的功能已有大量研究，但在木本植物中的功能研究較少。

巨桉(Eucalyptusgrandis)生長(zhǎng)快速，適應(yīng)性強(qiáng)，為紙漿和硬木的生產(chǎn)提供原材料(Myburgetal., 2014)。此外，桉樹可以吸收土壤中的重金屬，降低自然排水系統(tǒng)中的重金屬含量，減少礦山土壤的重金屬污染(Maitietal., 2017)。叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)與植物共生能夠緩解重金屬對(duì)宿主的毒害，香樟(Cinnamomumcamphora)接種幼套近明球囊霉(Claroideoglomusetunicatum)緩解鋁脅迫(閆明等， 2007)，刺槐(Robiniapseudoacacia)與摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)共生鉛耐受指數(shù)顯著提高(Huangetal., 2019)，紫穗槐(Amorphafruticosa)與摩西斗管囊霉共生過(guò)程中檢測(cè)到與重金屬結(jié)合的膜聯(lián)蛋白和金屬硫蛋白，這些蛋白有效地減輕重金屬對(duì)植物的毒害(宋福強(qiáng)等， 2014)。

桉樹是典型的菌根樹種，接種摩西斗管囊霉的桉樹苗生物量增加，Cu和Zn的含量顯著性降低，細(xì)胞壁對(duì)鉛的滯留和液泡對(duì)鉛的隔離作用增強(qiáng)(廖妤婕等， 2014)。本研究篩選到一個(gè)巨桉金屬耐受蛋白，命名為EgMTP6，對(duì)其生物信息學(xué)特征、亞細(xì)胞定位、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)功能和表達(dá)模式進(jìn)行分析，研究其在緩解鋅脅迫中的作用，為進(jìn)一步揭示磷、AMF與EgMTP6相互作用響應(yīng)鋅脅迫的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試微生物 1) 根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)于上海唯地生物技術(shù)有限公司。2) 釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)野生型BY4741和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體zrc1Δ，購(gòu)于歐洲酵母突變體庫(kù)。3) 異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)DAOM 197198孢子懸液，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)安建勇博士(購(gòu)于法國(guó)阿格瑞植物營(yíng)養(yǎng)公司Agronutrition，Toulouse)惠贈(zèng)。孢子懸液以白車軸草(Trifoliumrepens)為宿主富集培養(yǎng)3個(gè)月(唐明等， 2019)，將含有白車軸草根系、根外菌絲和孢子的混合物作為菌劑，孢子密度為15 個(gè)·mL-1，侵染率為63.3%。

1.1.2 供試植物 巨桉種子購(gòu)于廣州匯森林業(yè)有限公司。2% NaClO滅菌16 min，無(wú)菌水清洗5次； 置于1/4 MS(Murashige-Skoog)培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)3天，種子萌發(fā)后移至培養(yǎng)室培養(yǎng)14天； 將生長(zhǎng)狀態(tài)一致的巨桉幼苗移至裝有白沙(121 ℃滅菌2 h)的花盆(80 mm × 80 mm × 80 mm，121 ℃滅菌20 min)中培養(yǎng)14天，每天澆25 mL含300 μmol·L-1NaH2PO4的Long-Ashton營(yíng)養(yǎng)液(Hewitt, 1966)。培養(yǎng)室培養(yǎng)條件為： 16 h光照/8 h黑暗，光強(qiáng)度5 000 lx，溫度25 ℃，濕度60%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同鋅濃度和不同磷濃度分別處理巨桉實(shí)生苗 選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的巨桉幼苗，分別用含ZnSO4(5、50、500 μmol·L-1)(Fuetal., 2017)，NaH2PO4(30、300、3 000 μmol·L-1)(Fanetal., 2020)的Long-Ashton營(yíng)養(yǎng)液(Hewitt, 1966)處理，每個(gè)處理5 株，培養(yǎng)42天后，取根部鮮樣于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 巨桉實(shí)生苗接種異形根孢囊霉 選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的巨桉幼苗，接種處理組在巨桉根部附近接種15 mL菌劑； 對(duì)照組加入15 mL滅菌的菌劑，用含30 μmol·L-1NaH2PO4的Long-Ashton營(yíng)養(yǎng)液處理(Hewitt, 1966)。取樣方法同1.2.1。

1.2.3 巨桉根系異形根孢囊霉定殖情況 接種異形根孢囊霉的巨桉根系，參照Xie等(2016)方法使用熒光麥胚凝集素488對(duì)菌根樣品染色。熒光顯微鏡觀察異形根孢囊霉的定殖情況，統(tǒng)計(jì)定殖率和叢枝豐度(Trouvelotetal., 1986)。

1.2.4 基因克隆 稱取1 g巨桉根部冷凍樣品，提取總RNA(Perottoetal., 2014)。反轉(zhuǎn)錄采用HiScriptIII第一鏈cDNA合成試劑盒(+gDNA wiper，Vazyme，南京)，EgMTP6片段擴(kuò)增使用Phanta高保真聚合酶(Vazyme，南京)，具體流程參照說(shuō)明書，擴(kuò)增引物如表1。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 ExPASy分析基因序列特征，SACS HMMTOP預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白3D模型，MEGA11.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，GENEDOC進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。

1.2.6 煙草葉表皮亞細(xì)胞定位 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙(Nicotianatabacum)葉表皮亞細(xì)胞定位和檢測(cè)方法參照Pan等(2016)。表達(dá)載體為含有綠色熒光蛋白的pCanG-N(35 S∷eGFP)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記基因(HEDL∷mCherry)作為對(duì)照，片段合成引物如表1，激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光和紅色熒光。

1.2.7 釀酒酵母中異源表達(dá) 酵母突變體互補(bǔ)方法參照Ai等(2009)，表達(dá)載體為pFL61，片段合成引物如表1。

1.2.8 不同處理表達(dá)量分析 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)不同濃度鋅、不同濃度磷和異形根孢囊霉對(duì)巨桉EgMTP6表達(dá)量的影響，以巨桉泛素體蛋白基因(EgUBI3)為內(nèi)參(定量引物如表1)，使用熒光定量專用預(yù)混液(SYBR qPCR Master Mix，Vazyme，南京)，Bio-Rad iQ5檢測(cè)EgMTP6的表達(dá)量，采用2-ΔΔCt處理結(jié)果。

表1 所用引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in this work

2 結(jié)果與分析

2.1 EgMTP6的序列特征

在NCBI中進(jìn)行同源比對(duì)，從巨桉基因組中得到與AtMTP6(NP_182304.2)相似性為64%的蛋白序列，命名為EgMTP6?；蝾A(yù)測(cè)顯示EgMTP6含有一個(gè)長(zhǎng)度為1 524 bp的開(kāi)放閱讀框，包含12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子，編碼507個(gè)氨基酸(圖1A)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得克隆片段的大小(圖1B)。蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，EgMTP6相對(duì)分子質(zhì)量為55.39 kD，理論等電點(diǎn)為6.48，屬于堿性蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示：EgMTP6的氨基端位于膜內(nèi)側(cè)，羧基端位于膜外側(cè)，含有5個(gè)跨膜螺旋，在TMIII和TMIV螺旋之間是一個(gè)富含組氨酸的區(qū)域，位于TMII的HSVSD基序與連接TMV和TMIV環(huán)中的HHRAD基序是Fe/Zn-CDF特異性的基序(圖1C)。3D模型預(yù)測(cè)顯示:EgMTP6由2個(gè)亞鐵離子外排泵(ferrous iron efflux，F(xiàn)ieF； 模板SMTL ID： 3h90.1.A)組成。FieF的主要功能是通過(guò)膜轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+和Cd2+(Cotrimetal., 2019)，因此推測(cè)EgMTP6具有轉(zhuǎn)運(yùn)鋅的功能。

圖1 EgMTP6的基因和蛋白結(jié)構(gòu)特征Fig. 1 Structure features of EgMTP6A. ATG： 起始密碼子；TGA： 終止密碼子；黑色方塊： 外顯子；灰色線條： 內(nèi)含子； B. 凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大??； C. HD motifs 用箭頭表示；TMI-TMV： 跨膜結(jié)構(gòu)域；N： 氨基端；C： 羧基端； D. 以3h90.1.A為模版構(gòu)建EgMTP6的3D模型。A. ATG: Start codon; TGA: Stop codon; Black box: Exons; Gray lines: Introns; B. PCR-amplified product were gel electrophoresed; C. HD motifs were indicated by arrows; TM1-TM5： Transmembrane domain; N:-NH2; C:-COOH； D. The 3D model of EgMTP6 was constructed with 3h90.1.A as template.

2.2 EgMTP6的保守性分析

以NCBI和植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的AtMTP及OsMTP(Yuetal., 2018)，高粱(Sorghumbicolor)SbMTP6(XP_021307383.1)、毛果楊(Populustrichocarpa)PtMTP6 (POPTR_0002s20980)、黃瓜(Cucumissativus)CsMTP6(APM86801.1)、葡萄VvMTP6(GSVIVG01010968001)、香橙CitMTP6(Cs5g32700.1)和EgMTP6(KCW49998.1)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。植物CDF家族分為3個(gè)類群： Zn-CDF、Zn/Fe-CDF和Mn-CDF。Group1、Group5和Group12組成Zn-CDF。Group6和Group7組成Zn/Fe-CDF，Group8和Group9組成Mn-CDF。EgMTP6與CitMTP6相似性最高，與AtMTP6、CsMTP6、PtMTP6、VvMTP6、CitMTP6、OsMTP6、SbMTP6均屬于Group6，歸為Zn/Fe-CDF類群。對(duì)MTP6的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)(圖3)，發(fā)現(xiàn)MTP6具有較高的相似性，并且都含有FieF結(jié)構(gòu)域和HD-HD基序，說(shuō)明EgMTP6在進(jìn)化和結(jié)構(gòu)上具有保守性。

圖2 EgMTP6的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig. 2 Phylogenetic relationship of EgMTP6

圖3 MTP6多序列比對(duì)Fig. 3 Multiple sequence alignment of MTP6FieF用黑色框表示；HD motif用紅色線條表示。 The FieF was indicated by a black box; The HD motif were indicated by red line.

2.3 EgMTP6在煙草葉表皮細(xì)胞的定位

EgMTP6融合eGFP表達(dá)后注射煙草葉表皮，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白(HEDL)進(jìn)行共定位，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖4。對(duì)照組eGFP(35 S∷eGFP)在細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中都可以觀察到綠色熒光(圖4A)，說(shuō)明該定位系統(tǒng)在煙草葉表皮細(xì)胞中可以有效表達(dá)。融合表達(dá)EgMTP6的eGFP(35 S∷eGFP∷EgMTP6)在細(xì)胞核中不能觀察到綠色熒光(圖4B)，但細(xì)胞核周圍的絲狀放射線顯示綠色熒光，部分細(xì)胞膜呈不連續(xù)綠色熒光，這些是蛋白定位內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特征(Panetal., 2016)，并且綠色熒光在與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白的紅色熒光(HEDL∷mCherry)完全重合，說(shuō)明EgMTP6定位于煙草葉表皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

圖4 EgMTP6的亞細(xì)胞定位Fig. 4 Subcellular localization of EgMTP6A. 35S∷eGFP的熒光信號(hào)； B. EgMTP6與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白(HEDL∷mCherry)共定位的熒光信號(hào)； GFP：綠色熒光通道； BF：明場(chǎng)； GFP+BF：綠色熒光通道與明場(chǎng)疊加； mCherry：紅色熒光通道； GFP+mCherry：綠色熒光通道與紅色熒光通道疊加. 標(biāo)尺，50 μm。A. the green fluorescence protein of 35S∷eGFP。 B. fluorescence of co-transfering with endoplasmic reticulum marker (HEDL∷mCherry) of EgMTP6; GFP: Green fluorescence protein channe; BF: Bright field; GFP+BF: Green fluorescence protein channel overlapped with bright field; mCherry: Red fluorescence protein channel; GFP+mCherry: Green fluorescence protein channel overlapped with red fluorescence protein channel. Bar: 50 μm.

2.4 EgMTP6在釀酒酵母中的表達(dá)

zrc1Δ是釀酒酵母BY4741缺失液泡膜鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的突變體，可以將鋅轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中儲(chǔ)存(Lietal., 1998)，在BY4741和zrc1Δ中表達(dá)EgMTP6研究其轉(zhuǎn)運(yùn)鋅的能力。點(diǎn)斑試驗(yàn)結(jié)果顯示，在不添加和分別添加10和15 mmol·L-1ZnSO4的SD-Ura培養(yǎng)基上zrc1Δ和zrc1Δ-EgMTP6長(zhǎng)勢(shì)沒(méi)有顯著差異。但在含有20 mmol·L-1ZnSO4的SD-Ura培養(yǎng)基上，BY4741長(zhǎng)勢(shì)良好，而zrc1Δ不能生長(zhǎng)(圖5)，說(shuō)明Sczrc1將過(guò)量Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中，可緩解胞質(zhì)中過(guò)量Zn2+對(duì)BY4741生長(zhǎng)的抑制。zrc1Δ-EgMTP6在含有20 mmol·L-1ZnSO4的SD-Ura培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)弱于BY4741，但顯著強(qiáng)于zrc1Δ，說(shuō)明EgMTP6部分恢復(fù)了zrc1Δ轉(zhuǎn)運(yùn)鋅的功能。因此，在釀酒酵母中，EgMTP6部分恢復(fù)突變體zrc1Δ的遺傳缺陷，作為鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將胞質(zhì)中過(guò)量的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中。

圖5 EgMTP6在釀酒酵母中的表達(dá)Fig. 5 Expression of EgMTP6 in S. cerevisiae

2.5 鋅、磷和異形根孢囊霉對(duì)EgMTP6表達(dá)的影響

2.5.1 鋅、磷對(duì)EgMTP6基因表達(dá)的影響 熒光定量PCR結(jié)果顯示，不同濃度(5、50和500 μmol·L-1)ZnSO4的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)巨桉時(shí)，隨著鋅濃度的升高，EgMTP6的表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但差異不顯著(P< 0.05)(圖6A)，說(shuō)明EgMTP6的表達(dá)不受鋅濃度調(diào)控。用含低濃度(30 μmol·L-1)和中等濃度(300 μmol·L-1)磷的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)巨桉時(shí)，EgMTP6的表達(dá)量無(wú)顯著差異； 但在高濃度(3 000 μmol·L-1)磷處理時(shí)，EgMTP6的表達(dá)量是低濃度磷處理的1.9倍，是中等濃度磷處理的2.2倍，差異顯著(P< 0.05)(圖6B)，說(shuō)明EgMTP6的表達(dá)不受低濃度和中等濃度磷的影響，但受高濃度磷的誘導(dǎo)。

圖6 不同濃度鋅或磷處理時(shí)EgMTP6的表達(dá)Fig. 6 Expression of EgMTP6 with various levels of zinc or phosphorus concentration

2.5.2 異形根孢囊霉對(duì)EgMTP6表達(dá)的影響 對(duì)接種和未接種異形根孢囊霉的巨桉根樣品染色后在熒光顯微鏡下觀察，非菌根樣品中無(wú)侵染結(jié)構(gòu)，菌根樣品中可觀察到清晰的叢枝和根內(nèi)菌絲(圖7A)，侵染率為65.75%，叢枝豐度為49.2%(圖7B)，表明異形根孢囊霉達(dá)到有效侵染。以組成型表達(dá)的EgUBI3為內(nèi)參，檢測(cè)接種異形根孢囊霉(AM)和未接種異形根孢囊霉(NM)巨桉根系中EgMTP6的表達(dá)量。在轉(zhuǎn)錄水平上，EgMTP6的表達(dá)量在菌根組織中與非菌根組織中相比，差異顯著(P< 0.05)(圖7C)，說(shuō)明異形根孢囊霉侵染巨桉根系顯著誘導(dǎo)EgMTP6的表達(dá)。

圖7 異形根孢囊霉對(duì)EgMTP6表達(dá)的影響Fig. 7 Effect of AMF on EgMTP6 expressionA. 異形根孢囊霉定殖形態(tài)，a： 叢枝，ih： 根內(nèi)菌絲； B. 異形根孢囊霉定殖情況，F(xiàn)%： 侵染率，A%： 叢枝豐度； C. 異形根孢囊霉對(duì)EgMTP6表達(dá)的影響，AM： 菌根，NM： 非菌根。A. colonization morphology of AMF, a: Arbuscules, ih: Intraradical hyphae; B. AMF colonization, F%: The frequency of colonization, A%: The abundance of arbuscule abundance; C. Effect of R. irregularis on EgMTP6 expression, AM: AMF colonized roots, NM: AMF uncolonized roots.

3 討論

3.1 EgMTP6結(jié)構(gòu)和進(jìn)化的保守性

以AtMTP6序列為模版，在NCBI中檢索到2條蛋白序列，相似性為99.8%，僅存在一個(gè)氨基酸差異，將與AtMTP6同源性較高的序列命名為EgMTP6。EgMTP6跨膜結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的6個(gè)跨膜螺旋有所不同(Montaninietal., 2007)，這種差異可能是由于EgMTP6中HHRAD motif在跨膜螺旋外側(cè)造成的。EgMTP6為Fe/Zn-CDF類群，可轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+、Co2+、Cd2+、Ni2+等二價(jià)金屬離子(Montaninietal., 2007)。與EgMTP6位于同一分支上的AtMTP6在大腸桿菌(Escherichiacoli)中過(guò)表達(dá)，大腸肝菌在含有1 mmol·L-1ZnSO4的培養(yǎng)基中能正常生長(zhǎng)，但過(guò)表達(dá)AtMTP6的大腸桿菌生長(zhǎng)受抑制，推測(cè)AtMTP6將Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)內(nèi)，造成細(xì)胞內(nèi)Zn2+過(guò)量，抑制大腸桿菌生長(zhǎng)(吳平治等， 2006)。MTP6分支上的蛋白均具有FieF結(jié)構(gòu)域和HD-HD基序，細(xì)菌CDF家族的YiiP蛋白最早被稱為FieF，作為膜蛋白參與轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+和Cd2+(Cotrimetal., 2019)。x射線分析大腸桿菌 YiiP蛋白，發(fā)現(xiàn)分別位于第二和第四的跨膜螺旋的HD motif是金屬結(jié)合位點(diǎn)(Luetal., 2007)。EgMTP6同時(shí)具有FieF結(jié)構(gòu)域和HD-HD基序，在進(jìn)化關(guān)系和結(jié)構(gòu)上都具有保守性，推測(cè)EgMTP6可以轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+。

3.2 EgMTP6是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體

植物MTP蛋白多定位于細(xì)胞的膜系統(tǒng)(Gustinetal., 2011)，AtMTP2位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可將胞質(zhì)內(nèi)過(guò)量鋅轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Sinclairetal., 2018)。磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtPHO1在煙草葉表皮細(xì)胞中表達(dá)定位在高爾基體，高濃度磷處理表達(dá)AtPHO1的煙草葉片時(shí)，部分AtPHO1轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，促進(jìn)磷的外排(Arpatetal., 2012)。OsMTP11在煙草葉表皮細(xì)胞中定位在高爾基體，但在高濃度錳脅迫時(shí)，OsMTP11從高爾基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)移動(dòng)到質(zhì)膜，通過(guò)胞吐的方式把錳轉(zhuǎn)運(yùn)到膜外，緩解過(guò)量錳造成的脅迫(Maetal., 2018)。植物某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受到生物或非生物脅迫時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)的定位發(fā)生改變以適應(yīng)相應(yīng)的脅迫。煙草亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，EgMTP6定位于煙草葉表皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與鋅在胞質(zhì)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的轉(zhuǎn)運(yùn)。

酵母PMR1是定位在高爾基體的錳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)將胞質(zhì)中錳運(yùn)輸?shù)礁郀柣w，增強(qiáng)酵母對(duì)錳的耐受性(Tonetal., 2002)。定位在液泡膜的OsMTP8能回補(bǔ)pmr1Δ，恢復(fù)pmr1Δ對(duì)錳的耐受性，表明OsMTP8是錳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Erogluetal.， 2016)。zrc1Δcot1Δ是酵母液泡膜鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白雙突變體，對(duì)鋅敏感，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的AtMTP2能回補(bǔ)zrc1Δcot1Δ，恢復(fù)zrc1Δcot1Δ對(duì)鋅的耐受性，表明AtMTP2作為鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將細(xì)胞內(nèi)過(guò)量鋅轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Sinclairetal., 2018)。敲除zrc1的酵母突變體zrc1Δ對(duì)鋅敏感(Lietal., 1998)，在zrc1Δ中表達(dá)EgMTP6后，zrc1Δ能在含有20 mmol·L-1ZnSO4的SD-Ura培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但長(zhǎng)勢(shì)弱于BY4741，表明zrc1Δ中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能得到部分恢復(fù)，進(jìn)一步證明EgMTP6是鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

研究還發(fā)現(xiàn)，部分MTP在轉(zhuǎn)錄水平上不受轉(zhuǎn)運(yùn)底物濃度調(diào)控。AtMTP11在維持細(xì)胞內(nèi)錳穩(wěn)態(tài)和耐受性方面發(fā)揮重要作用，但其表達(dá)量不受錳濃度的調(diào)控(Delhaizeetal., 2007)。CsMTP5與CsMTP12以異源二聚體形式轉(zhuǎn)運(yùn)鋅，過(guò)量鋅條件下，CsMTP5的表達(dá)受到抑制，鋅缺乏時(shí)，CsMTP5表達(dá)受到誘導(dǎo)； 而CsMTP12的表達(dá)不受鋅濃度變化的影響(Migockaetal.， 2018)。EgMTP6的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上不受鋅濃度調(diào)控，可能在轉(zhuǎn)錄后水平或翻譯水平調(diào)控鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)。

3.3 磷、AMF與EgMTP6的相互關(guān)系

一些作物體內(nèi)的磷和鋅的積累呈負(fù)相關(guān)，鋅含量隨磷的施用而降低，而施鋅使磷含量降低(Dingetal., 2021)。Bouain等(2014)發(fā)現(xiàn)隨著磷濃度的增加，萵苣(Lactucasativa)根部鋅濃度降低，說(shuō)明植物磷含量調(diào)控對(duì)鋅的吸收。因此，施加磷肥可以降低植物對(duì)鋅的吸收，從而緩解過(guò)量鋅對(duì)植物的毒害作用。植物不僅可以通過(guò)減少對(duì)鋅的吸收降低細(xì)胞內(nèi)的鋅含量，還可以將鋅轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞器或胞外降低胞質(zhì)中鋅含量。EgMTP6是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。低濃度和中等濃度磷處理時(shí)，EgMTP6表達(dá)量無(wú)顯著變化； 高濃度磷處理時(shí)，EgMTP6表達(dá)量顯著增加，推測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷含量的增加，促進(jìn)胞質(zhì)鋅到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)，降低胞質(zhì)中鋅含量。

AMF通過(guò)菌根途徑為宿主提供90%的磷(Van der Heijdenetal., 2008)。Zhang等(2017)發(fā)現(xiàn)玉米(Zeamays)形成菌根后，根部出現(xiàn)磷積累、鋅缺乏。AMF可以通過(guò)增加宿主的磷營(yíng)養(yǎng)來(lái)調(diào)控宿主體內(nèi)的鋅含量。Burleigh等(2003)報(bào)道蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)MtZIP2具有吸收鋅的功能，接種AMF時(shí)MtZIP2表達(dá)量下調(diào)，根部的鋅含量降低，說(shuō)明AMF抑制MtZIP2的表達(dá)，降低對(duì)鋅的吸收。AMF通過(guò)增加宿主的磷營(yíng)養(yǎng)來(lái)調(diào)控宿主鋅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)。接種異形根孢囊霉后，EgMTP6表達(dá)量升高，異形根孢囊霉為巨桉提供磷，促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)過(guò)量鋅轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。因此，在巨桉菌根中異形根孢囊霉通過(guò)為宿主提供磷，誘導(dǎo)EgMTP6表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胞質(zhì)中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，降低胞質(zhì)中鋅含量，緩解高鋅脅迫。

4 結(jié)論

EgMTP6屬于Fe/Zn-CDF家族，編碼507個(gè)氨基酸，包含12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子。蛋白氨基端位于細(xì)胞內(nèi)，羧基端位于細(xì)胞外，且包含5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)和HD-HD基序。EgMTP6是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但EgMTP6的表達(dá)不受鋅濃度影響。高濃度磷和異形根孢囊霉誘導(dǎo)EgMTP6的表達(dá)。EgMTP6在分子特征和功能方面的研究將有助于進(jìn)一步探討該基因在巨桉菌根耐受重金屬的分子機(jī)制。