辣椒遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究

郭紅艷, 隋益虎, 胡能兵

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

辣椒(CapsicumannuumL.)為茄科辣椒屬常異花授粉的一年生或多年生草本植物[1],原產(chǎn)于南美和墨西哥等中美洲熱帶地區(qū),在世界上廣泛栽培[2]。在我國,辣椒栽培面積共有3 200萬畝、約200萬hm2,其生產(chǎn)價值和經(jīng)濟效益都名列前茅,是我國重要的經(jīng)濟蔬菜作物[3-4]。辣椒中有12對染色體,其基因組約3.2～3.9 G,為同為茄科植物中番茄、茄子基因組的3～5倍。辣椒基因組包含著大量的重復(fù)序列,占整個基因組的81%,遠高于馬鈴薯和西紅柿[5]。與番茄、茄子相比,辣椒生物技術(shù)育種方面還存在著較大的差距[6],主要原因在于尚未有簡便快捷的辣椒轉(zhuǎn)基因體系,而現(xiàn)有報道的辣椒基因的功能大多都是通過VIGS[7]或借助于外源植物煙草[8]、擬南芥[9]來實現(xiàn),這極大地限制了辣椒生物技術(shù)育種的速度?；诖?本實驗對影響辣椒遺傳轉(zhuǎn)化的各因素進行研究,為后續(xù)的應(yīng)用提供較好的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1.1 辣椒材料 BY-1,由安徽科技學(xué)院辣椒課題組提供。

1.1.2 根癌農(nóng)桿菌菌株 使用農(nóng)桿菌GV3101,植物表達載體為pR101-GFP(卡那霉素抗性),載體所含基因為CYP85A1(圖1)。

圖1 pR101-GFP載體結(jié)構(gòu)示意圖

1.1.3 農(nóng)桿菌培養(yǎng)基 固/液體LB培養(yǎng)基+50 mg/L Kan(卡那霉素)+25 mg/L Rif(利福平)pH 7.0;植物組織再生培養(yǎng)基:(1) 不定芽誘導(dǎo):M S+4 mg/L 6-BA(6-芐氨基嘌呤)+3.0%糖+8 g/L瓊脂pH 6.5。(2) 芽伸長培養(yǎng)基:MS+4 mg/L 6-BA+3.0%糖+8 g/L瓊脂+0.5 mg/L GA3(赤霉素)pH 6.5。(3) 生根培養(yǎng)基:1/2MS+3.0%糖+8 g/L瓊脂pH 6.5。

表1 不同階段培養(yǎng)基成分

1.1.4 實驗儀器 高溫高壓滅菌鍋；超凈工作臺；離心機；恒溫振蕩搖床；PCR儀；凝膠成像儀。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃;光照強度為2 000 lx、16 h/d,白光燈。每次處理含外植體30個,3次重復(fù)。

1.2.2 無菌苗的獲得 流水清洗辣椒種子3 min,在無菌超凈工作臺上用75%乙醇中滅菌1 min,用0.1%升汞滅菌2 min,無菌水清洗3～5遍,晾干水分,轉(zhuǎn)接到萌發(fā)培養(yǎng)基中,于25～28 ℃培養(yǎng)成幼苗。

1.2.3 外植體的準備 取苗齡14～16 d的BY-1無菌苗,取子葉用于后續(xù)試驗。

1.2.4 農(nóng)桿菌侵染液的準備 在50 mg/L Kan+25 mg/L Rif+15 g/L瓊脂的固體LB培養(yǎng)基上劃線接種帶有目的基因的農(nóng)桿菌,挑取28 ℃暗培養(yǎng)2 d下的單菌落轉(zhuǎn)接至上述的2 mL LB溶液中,在28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h后,繼續(xù)擴大培養(yǎng);5 000 r/min收集菌體,用侵染液(MS+200 μmol/L AS(乙酰丁香酮))將其懸浮至OD600在0.6和0.8之間。

1.2.5 辣椒子葉的侵染 將子葉放入活化農(nóng)桿菌的侵染液中,搖動0、10、20、30、40、50、60 min,在無菌濾紙上晾干水分,轉(zhuǎn)接到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+4 mg/L 6-BA+50 mg/L AS+3%糖+8 g/L瓊脂),25 ℃暗培養(yǎng)2 d之后,無菌水清洗3～5遍,一定濃度的特美汀溶液浸泡,無菌濾紙上晾干水分,轉(zhuǎn)接到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+4 mg/L 6-BA+200 mg/L TMT(特美汀)+50 mg/L Kan+3%糖+8 g/L瓊脂),每2周統(tǒng)計數(shù)據(jù),直至子葉長出芽點。

1.2.6 伸長 將生長出的芽點轉(zhuǎn)接至伸長培養(yǎng)基(MS+4 mg/L 6-BA+10 mg/L IAA+0.5 mg/L GA3(赤霉素)+200 mg/L TMT+50 mg/L Kan+3%糖+8 g/L瓊脂)中培養(yǎng),每2周統(tǒng)計數(shù)據(jù),直至植株伸長。

1.2.7 生根 切下約1 cm的伸長小芽插入生根培養(yǎng)基(1/2MS+200 mg/L TMT+50 mg/L Kan+3%糖+8 g/L瓊脂)誘導(dǎo)生根。

1.2.8 移栽 將組培苗洗去根部培養(yǎng)基,移植到基質(zhì)中,在 25～30 ℃下煉苗移栽。

1.2.9 轉(zhuǎn)基因辣椒的分子檢測 對獲得的轉(zhuǎn)化植株和未轉(zhuǎn)化植株的葉片,采用CTAB法[10-11]提取葉片總DNA,利用引物擴增進行PCR檢測。本試驗所用的目的基因是CYP85A1,該基因變?yōu)? 395 bp。

PCR檢測:根據(jù)pR101-GFP上基因的序列設(shè)計引物,如下:

CYP85A1-F1-SalI:GTCGACATGGCCTTTTTCTTAGTTT ;CYP85A1-R1-PstI:CTGCAGTTAATTAGTTGAAACTCTAATTCG,反應(yīng)條件為預(yù)處理95 ℃ 5 min(95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,每周期35個循環(huán)),最后72 ℃延長10 min,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測該基因是否轉(zhuǎn)入至辣椒中。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同卡那霉素濃度對辣椒子葉誘導(dǎo)的影響

為篩選最佳濃度的卡那霉素,將子葉外植體接種于不同濃度的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上,觀察其生長情況。由表2可知,隨著卡那霉素濃度的增加,子葉愈傷組織的發(fā)生和外植體抗性芽個數(shù)都呈先高后低的趨勢。且當(dāng)Kan濃度為50 mg/L時,其愈傷誘導(dǎo)率與抗性芽數(shù)為36.67%和0.90個,效果較好。故本實驗中選擇以50 mg/L的卡那霉素篩選辣椒抗性芽。

表2 卡那霉素濃度對辣椒子葉的影響

2.2 不同侵染時間對辣椒子葉的影響

在構(gòu)建高效的辣椒遺傳轉(zhuǎn)化體系的時候,合適的侵染時間也是最為關(guān)鍵的過程。由表3可知,隨著農(nóng)桿菌侵染時間的延長,其愈傷誘導(dǎo)和抗性芽的發(fā)生呈先高后低的趨勢。在侵染時間30 min時,其愈傷誘導(dǎo)與抗性芽個數(shù)較大為37.78%和2.10個,明顯高于其他處理。而在侵染時間為0和60 min時,愈傷誘導(dǎo)率和抗性芽個數(shù)明顯低于其他處理。表明侵染時間過短和過長都不利于辣椒的遺傳轉(zhuǎn)化,故本實驗選擇30 min的侵染時間。

表3 不同侵染時間對辣椒子葉的影響

2.3 特美汀(TMT)溶液浸泡時間對農(nóng)桿菌的抑制影響

適宜的TMT溶液浸泡時間來抑制農(nóng)桿菌的生成,是決定外植體能否再生的重要過程。由表4可知，隨著外植體在TMT溶液浸泡時間的延長,其抗性芽個數(shù)呈先升后降的趨勢,且外植體生長狀況也出現(xiàn)了由污染到失綠的過程。表明過短或過長的浸泡時間都不利于農(nóng)桿菌的抑制,且較為適宜的浸泡時間為3 min。

表4 特美汀水溶液浸泡時間對農(nóng)桿菌的抑制

2.4 不同赤霉素濃度對辣椒遺傳轉(zhuǎn)化苗伸長的影響

將產(chǎn)生的不定芽點,接種到表5所示培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。隨著赤霉素濃度的增加,其褐化誘導(dǎo)率呈先升后降的趨勢,而抗性芽伸長個數(shù)則呈下降趨勢,而添加赤霉素濃度為0.5 mg/L時抗性芽個數(shù)伸長達到最大,為0.23個。得出抗性芽點伸長的赤霉素濃度為0.5 mg/L。

表5 不同赤霉素濃度對辣椒抗性芽伸長的影響

2.5 不同激素組合對辣椒子葉遺傳轉(zhuǎn)化苗生根的影響

將伸長至1 cm 左右的不定芽,接種至表6所示的培養(yǎng)基中培養(yǎng)生根。3號培養(yǎng)基的外植體生根率最高,達到52.22%;而1～2號上的全部死亡,差異明顯;添加NAA的4～6號培養(yǎng)基,產(chǎn)生大量愈傷組織,影響外植體根系發(fā)育;故本實驗選用3號培養(yǎng)基用來生根。

表6 辣椒子葉遺傳轉(zhuǎn)化苗生根效果

2.6 轉(zhuǎn)基因植株的獲得與檢測

2.6.1 轉(zhuǎn)基因植株 通過本試驗中的卡那霉素,農(nóng)桿菌侵染時間、最佳侵染時間、特美汀溶液浸泡時間、不定芽伸長等各因素來獲得轉(zhuǎn)基因植株,具體內(nèi)容如圖2所示。

圖2 不同階段外植體形態(tài)狀況

2.6.2 轉(zhuǎn)基因植株結(jié)果檢測 對獲得的46個辣椒單株進行PCR檢測,結(jié)果有8個單株擴增出與陽性對照相同的條帶,轉(zhuǎn)基因比例為17.4%。

圖3 部分轉(zhuǎn)基因辣椒PCR擴增結(jié)果圖

3 結(jié)論與討論

至今,遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已成為獲得轉(zhuǎn)基因植物的基本方法,而以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法在茄科植物中的茄子[12-13]、番茄[14-16]、辣椒[17-19]等已初步取得成功。但由于在辣椒的遺傳背景影響較大,目前還存在著一些問題,因此創(chuàng)建一個簡潔穩(wěn)定的辣椒遺傳轉(zhuǎn)化體系是很有必要的。本試驗以辣椒子葉為外植體,以組織培養(yǎng)再生體系[20-22]為基礎(chǔ)來探尋影響辣椒遺傳轉(zhuǎn)化的各因素,為下一步外源基因的導(dǎo)入,快速獲得辣椒轉(zhuǎn)基因植株,基因功能的研究等創(chuàng)造條件。

在整個遺傳轉(zhuǎn)化的過程中,陽性轉(zhuǎn)化的篩選是一個重要的過程。而Kan濃度、農(nóng)桿菌侵染時間、TMT抑菌時間,芽伸長等都是遺傳轉(zhuǎn)化的重要過程。如何選擇適宜的Kan濃度來抑制假陽性芽的形成。羅齊軍等[23]認為35 mg/L Kan較好,而袁靜等[24]則認為50 mg/L Kan對辣椒外植體篩選濃度影響最佳,這與本試驗結(jié)果相同。適宜的侵染時間也十分重要,若侵染時間過長在后期的培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)農(nóng)桿菌殘留,且難以控制導(dǎo)致植株死亡,侵染時間過短菌液與外植體接觸不夠充分,會降低轉(zhuǎn)化效率導(dǎo)致大量非抗性苗出現(xiàn);本實驗中一定的侵染時間可增強辣椒的再生頻率與再生芽效果[25],這與黃妤等[26]的研究大致相同。TMT作為一種新型抑菌劑,可用來抑制農(nóng)桿菌的發(fā)生,這在遺傳轉(zhuǎn)化后期添加很有必要。敬國興等[27]發(fā)現(xiàn)，如果濃度過低的TMT也會引起農(nóng)桿菌的發(fā)生造成植株死亡,且用TMT溶液浸泡過后的抑菌效果會更好。植物再生過程中不定芽的伸長是關(guān)鍵,添加赤霉素極為重要,它能使不定芽點得到一定程度的伸長,這與歐陽樂軍等[28]研究結(jié)果一致。

綜上，本實驗建立了一個穩(wěn)定的辣椒遺傳轉(zhuǎn)化體系。確定了卡那霉素濃度為50 mg/L,侵染時間為30 min,特美汀溶液浸泡辣椒子葉時間為3 min,不定芽伸長添加赤霉素濃度為0.5 mg/L，使辣椒的遺傳轉(zhuǎn)化達到較好效果,為后期的辣椒生物技術(shù)育種和基因工程研究提供較好的技術(shù)支撐。