不同日齡黃淮白山羊子宮組織結(jié)構(gòu)增齡性變化觀察

張文靜， 汪來香， 顧有方， 胡 博， 周金星

(安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 安徽省動(dòng)物營養(yǎng)調(diào)控與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 鳳陽 233100)

子宮是胚胎附植及孕育胎兒的器官，在動(dòng)物生長發(fā)育過程中子宮經(jīng)歷一系列有規(guī)律的周期性變化。子宮從內(nèi)到外分為內(nèi)膜、肌層和外膜三層，其中子宮內(nèi)膜是胚胎植入的關(guān)鍵，對動(dòng)物妊娠、繁殖具有重要意義[1]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對動(dòng)物子宮組織結(jié)構(gòu)的研究主要有牦牛發(fā)情周期子宮組織結(jié)構(gòu)的觀察[2]、超數(shù)排卵處理對小鼠子宮組織結(jié)構(gòu)的影響[3]、兔不同時(shí)期子宮組織結(jié)構(gòu)變化的研究[4-5]、蝙蝠雌性生殖器官在不同生殖階段的組織形態(tài)變化[6]、水牛發(fā)情周期子宮的組織學(xué)和組織形態(tài)計(jì)量學(xué)變化[7]等。

黃淮白山羊因廣泛分布在黃淮流域而得名，是繁殖性能較高的肉皮兼用品種之一，也是安徽省優(yōu)良的地方品種之一，對不同生態(tài)環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，抗病力和繁殖力強(qiáng)。目前，對黃淮白山羊的組織形態(tài)學(xué)研究主要集中在蹄部[8]、舌黏膜[9]、毛囊皮膚[10]、心臟冠狀動(dòng)脈[11]、胸腺[12]和腸道黏膜[13-14]等器官組織結(jié)構(gòu)的觀察。對于黃淮白山羊子宮的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)尚無報(bào)道。因此，本研究通過不同日齡黃淮白山羊子宮的組織結(jié)構(gòu)增齡性變化觀察，以期為黃淮白山羊子宮形態(tài)學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

20只2～3歲健康雌性黃淮白山羊選自安徽利辛綠墅農(nóng)牧有限公司,同期發(fā)情處理,并采用人工授精技術(shù)使之妊娠，精液來自2～3歲健康黃淮白山羊公羊。健康母羔羊按日齡分為5組：3、30、60、90和120日齡組，每個(gè)日齡組選取體質(zhì)均一的3只宰殺，共計(jì)15只。母羊與羔羊均采用舍飼，自由采食飲水。

1.2 樣品采集

各日齡組山羊均經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死后，迅速剖檢取子宮立即放入4%中性多聚甲醛溶液中固定備用。

1.3 主要儀器設(shè)備

RM2235手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國徠卡);HI1210攤片機(jī)(德國徠卡);HI1220烘片機(jī)(德國徠卡);BX63正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.4 石蠟切片制作

取固定好的不同日齡黃淮白山羊子宮組織，流水沖洗24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，制作5 μm厚切片，進(jìn)行HE、阿利新藍(lán)過碘酸雪夫氏(AB-PAS)和Verhoeff VG(VVG)染色，顯微鏡觀察并照相。

1.5 圖像統(tǒng)計(jì)分析

用Olympus BX63(DP74)顯微成像系統(tǒng)對子宮切片進(jìn)行觀察。每只羊取10張組織切片，在100倍放大倍數(shù)下，每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野觀察。利用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件和顯微測微系統(tǒng)對相關(guān)參數(shù)進(jìn)行測量。包括：(1)子宮內(nèi)膜和子宮肌層厚度(子宮內(nèi)膜厚度包括子宮肉阜和子宮區(qū)間厚度，均采用最高點(diǎn)進(jìn)行測量)；(2)子宮內(nèi)膜的黏膜上皮和腺上皮高度；(3)每平方毫米子宮內(nèi)膜內(nèi)子宮腺管的數(shù)量。利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同日齡黃淮白山羊子宮組織結(jié)構(gòu)變化特點(diǎn)

黃淮白山羊子宮壁從內(nèi)至外可分為內(nèi)膜層、肌層和外膜3層。子宮內(nèi)膜上皮為假復(fù)層柱狀上皮或單層柱狀上皮，上皮細(xì)胞有分泌功能。固有層分淺層和深層，淺層位于內(nèi)膜上皮下方，靠近子宮腔體，主要由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，內(nèi)含大量細(xì)胞、纖維和血管；深層細(xì)胞成分較少，有大量分支管狀的子宮腺，與肌層相鄰，為基底層。

2.1.1 3日齡黃淮白山羊子宮組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 3日齡子宮內(nèi)膜的黏膜層由上皮和固有層構(gòu)成，見少量黏膜皺襞，上皮為假復(fù)層柱狀上皮，有少量微絨毛結(jié)構(gòu)，子宮肌層由內(nèi)環(huán)、外縱平滑肌組成，外膜屬漿膜性結(jié)構(gòu)，由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，3日齡肌層，外膜較薄(圖1A)。上皮細(xì)胞由大量分泌細(xì)胞組成，細(xì)胞呈高柱狀，體積較大，胞核染色深，位于細(xì)胞中央呈橢圓形，胞質(zhì)弱嗜酸性，上皮頂部見分泌細(xì)胞含核的突起。上皮間有散在的淋巴細(xì)胞，主要分布于基膜上，少數(shù)見于上皮細(xì)胞之上(圖1B)。AB-PAS染色可見子宮內(nèi)膜的黏膜上皮和血管上皮有陽性反應(yīng)，但顏色較淺，含量少(圖2A)。VVG染色未觀察到纖維分布(圖2B)?？捎^察到子宮腺發(fā)育形態(tài)，但極少見發(fā)育完整的子宮腺體(圖3A)。

2.1.2 30日齡黃淮白山羊子宮組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 30日齡子宮內(nèi)膜的黏膜上皮已由假復(fù)層柱狀纖毛上皮轉(zhuǎn)變?yōu)閱螌又鶢钌掀ぃ?，外膜均增?圖1C)。黏膜上皮細(xì)胞呈“柵欄狀”排列，主要由分泌細(xì)胞構(gòu)成，游離面見大量微絨毛結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈方柱狀，體積較3日齡變大。黏膜的固有層中可見大量的淋巴細(xì)胞分布(圖1D)。AB-PAS染色可見基膜呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，黏膜上皮陽性分泌顆粒增多(圖2C)。VVG染色固有層中已能觀察到少量膠原纖維(圖2D)。子宮腺體發(fā)育完整，但數(shù)量較少(圖3B)。

2.1.3 60日齡黃淮白山羊子宮組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 60日齡子宮形態(tài)發(fā)育完全，子宮內(nèi)膜的黏膜層上皮細(xì)胞顯著變矮，游離面可見微絨毛結(jié)構(gòu)，內(nèi)環(huán)、外縱肌中間有豐富的血管及淋巴管，為子宮內(nèi)膜提供營養(yǎng)。外膜厚度與30日齡相差不大，但外縱肌增厚明顯(圖1E)。子宮內(nèi)膜的黏膜上皮和腺上皮之間可觀察到散在的淋巴細(xì)胞(圖1F)。AB-PAS染色可見其子宮內(nèi)膜的黏膜上皮、腺上皮和基質(zhì)中均有陽性分泌顆粒，其中基膜和黏膜上皮呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，而腺上皮和基質(zhì)中含量較少(圖2E)。VVG染色顯示膠原纖維增多(圖2F)。子宮腺數(shù)量明顯增多，并觀察到固有層中深層子宮腺體(圖3C)和淺層正在增殖發(fā)育的子宮腺體(圖3D)。腺上皮為單層柱狀上皮，深層子宮腺上皮細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞呈長桿狀或錐形，染色深，胞質(zhì)強(qiáng)嗜酸性；淺層子宮腺上皮細(xì)胞呈卵圓形，染色淺，胞質(zhì)弱嗜酸性。

2.1.4 90日齡黃淮白山羊子宮組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 90日齡子宮肌層，外膜增厚(圖1G)。子宮內(nèi)膜的黏膜層上皮細(xì)胞呈矮柱狀，黏膜上皮和腺上皮之間仍可觀察到散在的淋巴細(xì)胞(圖 1H)。AB-PAS染色可見子宮內(nèi)膜的黏膜上皮、腺上皮和固有層基質(zhì)中陽性反應(yīng)增多(圖2G)。VVG染色可見較豐富的膠原纖維(圖2H)。深層子宮腺上皮增生出現(xiàn)少量彎曲(圖3E)。淺層子宮腺發(fā)育完全，主分布于近子宮內(nèi)膜的黏膜上皮處(圖3F)。

2.1.5 120日齡黃淮白山羊子宮結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 隨著子宮的發(fā)育，120日齡子宮肌層、外膜持續(xù)增厚，此時(shí)肌層的內(nèi)環(huán)肌較外縱肌厚(圖1I)。子宮內(nèi)膜的黏膜上皮細(xì)胞呈圓柱狀，胞質(zhì)突向子宮腔，黏膜上皮和腺上皮之間有散在淋巴細(xì)胞分布(圖1J)。AB-PAS染色可見子宮內(nèi)膜的黏膜上皮和固有層中陽性反應(yīng)顆粒含量多(圖2I)。VVG染色可見分布規(guī)律的成纖維細(xì)胞和大量的膠原纖維(圖2J)。子宮腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)突起，深層子宮腺稠密，腺變長而彎曲，子宮腺腔內(nèi)見分泌物(圖3G)。淺層子宮腺體積大而圓，數(shù)量少于深層(圖3H)。

圖1 不同日齡黃淮白山羊子宮組織結(jié)構(gòu)

圖2 不同日齡黃淮白山羊子宮糖原和纖維的分布

圖3 不同日齡黃淮白山羊子宮腺發(fā)育形態(tài)

2.2 不同日齡黃淮白山羊子宮組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)比較

2.2.1 子宮內(nèi)膜的黏膜上皮和腺上皮高度 黃淮白山羊不同日齡子宮內(nèi)膜上皮和腺上皮變化明顯。圖4表明，3和120日齡子宮肉阜上皮、肉阜區(qū)間上皮高度差異不顯著(P>0.05)，與90日齡差異顯著(P<0.05)。3日齡為假復(fù)層柱狀上皮，其他日齡為單層柱狀上皮。30和60日齡子宮肉阜上皮、肉阜區(qū)間上皮高度差異不顯著(P>0.05)。3、30和60日齡子宮腺上皮高度差異不顯著(P>0.05)，與90日齡差異顯著(P<0.05)。90和120日齡子宮腺上皮高度差異不顯著(P>0.05)。

圖4 不同日齡黃淮白山羊內(nèi)膜上皮和腺上皮高度

2.2.2 子宮內(nèi)膜和子宮肌層厚度 圖5表明，3～120日齡子宮肉阜、子宮肉阜區(qū)間和子宮肌層的厚度呈顯著上升趨勢(P<0.05)且達(dá)到峰值。3與30日齡子宮肉阜和子宮肉阜區(qū)間厚度差異不顯著(P>0.05)，30～120日齡子宮肉阜和子宮肉阜區(qū)間厚度差異顯著(P<0.05)，其中60日齡與90、120日齡差異極顯著(P<0.01)。3、30和60日齡子宮肌層厚度差異不顯著(P>0.05)，60日齡與90和120日齡子宮肌層厚度差異顯著(P<0.05)。

圖5 不同日齡黃淮白山羊子宮壁各層的厚度

2.2.3 黃淮白山羊子宮腺數(shù)量分布 圖6表明,黃淮白山羊不同日齡時(shí)期子宮腺數(shù)量變化明顯，3和30日齡子宮腺數(shù)量差異不顯著(P>0.05)，與60日齡差異顯著(P<0.05)，且達(dá)到峰值。90和120日齡差異不顯著(P>0.05)，與60日齡差異顯著(P<0.05)。

圖6 不同日齡黃淮白山羊子宮腺數(shù)量

3 結(jié)論與討論

動(dòng)物子宮是受孕、胚胎植入、生長和胎盤形成的關(guān)鍵，與胎兒成活、產(chǎn)仔密切相關(guān)。本試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)黃淮白山羊子宮的一般組織結(jié)構(gòu)與綿羊[15]、豬[16]、牛[17]、鼠[18]等哺乳動(dòng)物子宮結(jié)構(gòu)類似。子宮內(nèi)膜的黏膜上皮類型隨日齡增加由假復(fù)層纖毛上皮分裂增生為排列整齊緊密的單層柱狀上皮，且由高柱狀隨日齡增加逐漸變化為矮柱狀和圓柱狀，120日齡時(shí)子宮內(nèi)膜的黏膜上皮細(xì)胞呈高圓柱狀，此年齡段上皮細(xì)胞活性顯著。張日華等[19]在雌激素對子宮的作用研究中發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物去勢后在雌激素的替代下，子宮內(nèi)膜明顯增厚,子宮內(nèi)膜的黏膜上皮細(xì)胞顯著增大。因此，研究推測黃淮白山羊子宮增厚，子宮內(nèi)膜上皮增高是雌激素和動(dòng)物生長發(fā)育的結(jié)果。黃淮白山羊子宮內(nèi)膜的黏膜上皮主要由分泌細(xì)胞構(gòu)成，黏膜上皮和腺上皮中有散在的淋巴細(xì)胞分布，與Wiley等[15]對綿羊子宮觀察的結(jié)果一致。此外，陳秋生等[20]在雙峰駝子宮黏膜上皮和子宮腺上皮中也觀察到上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，認(rèn)為子宮內(nèi)有豐富的彌散免疫細(xì)胞，尤其子宮腺是參與黏膜免疫的重要組成部分。因此推測黃淮白山羊子宮黏膜是其行使黏膜免疫功能的重要組成部分。本研究利用ABPAS試驗(yàn)方法觀察到不同日齡黃淮白山羊子宮內(nèi)膜中糖原的分布，隨日齡的增長PAS陽性反應(yīng)逐漸增強(qiáng)。子宮內(nèi)膜基質(zhì)中主要成分是粘多糖，其主要功能是為子宮發(fā)育維持內(nèi)壞境穩(wěn)定和胚胎發(fā)育提供能量，且子宮分泌產(chǎn)物是建立子宮容受性和著床的明確要求[21]。Billings等[22]研究表明子宮內(nèi)膜腺分泌糖原、糖蛋白、粘多糖和各種酶，子宮內(nèi)膜腺的分泌主要是由腺上皮分泌和內(nèi)膜上皮分泌。子宮腺的分泌方式主要是頂漿分泌[23]。本研究發(fā)現(xiàn)黃淮白山羊子宮內(nèi)膜上皮和腺上皮在120日齡時(shí)胞質(zhì)突起，上皮細(xì)胞增厚，形成頂漿分泌，因此120日齡時(shí)子宮內(nèi)膜和基質(zhì)中陽性反應(yīng)最高；Spencer等[24]人研究結(jié)果表明，綿羊子宮腺在0～7日齡開始發(fā)育，56日齡子宮腺組織結(jié)構(gòu)上已經(jīng)發(fā)育完整，但最終成熟和生長要等性成熟以后。Bukar等[25]研究發(fā)現(xiàn)薩赫勒山羊3月齡時(shí)子宮組織形態(tài)發(fā)育完成，豬[16]的子宮組織結(jié)構(gòu)在120天內(nèi)發(fā)育成熟。本研究發(fā)現(xiàn)黃淮白山羊出生后3日齡觀察到正在發(fā)育中的子宮腺體，到60日齡時(shí)腺體數(shù)量最多，120日齡時(shí)腺體形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)育成熟；Allison等[26]認(rèn)為子宮內(nèi)膜腺體及其分泌物對胚胎發(fā)育至關(guān)重要，細(xì)胞表面和分泌蛋白表達(dá)與子宮組織形態(tài)有關(guān)。本研究結(jié)果表明，黃淮白山羊120日齡時(shí)子宮內(nèi)膜和子宮腺管中可觀察到大量糖原分布，此時(shí)子宮腺發(fā)育成熟。

通過本研究觀察，可見子宮內(nèi)膜固有層中有膠原纖維成分，從30日齡開始觀察到纖維出現(xiàn)，隨日齡增長纖維成分增多，到120日齡時(shí)大量的膠原纖維分布于子宮內(nèi)膜固有層中，膠原纖維對妊娠有重要作用。子宮內(nèi)膜和子宮肌層厚度在90日齡左右增長迅速，這與Ramos等[27]對犬子宮組織形態(tài)的研究結(jié)果一致，子宮內(nèi)膜、肌層在3月齡時(shí)發(fā)育最明顯。黃淮白山羊120日齡時(shí)子宮內(nèi)膜和子宮肌層厚度達(dá)到最佳狀態(tài)。黃淮白山羊120日齡子宮上皮細(xì)胞活性顯著，子宮腺發(fā)達(dá)，糖原分泌物增多、纖維成分豐富，內(nèi)膜平滑肌發(fā)達(dá)，此時(shí)子宮組織結(jié)構(gòu)發(fā)育成熟。