Apelin-36對魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡及線粒體功能的影響*

竇姍姍 高麗穎 林馨怡 孟 堯 董 康 程葆華

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧 272067)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的神經(jīng)退行性疾病[1]，其主要病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生退行性變，并伴有路易氏小體(Lewy body，LB)出現(xiàn)。LB主要是由于α-突觸核蛋白(α-synuclein)的異常積累形成的[2]。PD的發(fā)病機(jī)制還不清楚，而線粒體功能障礙與PD發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[3-4]。

魚藤酮(rotenone)是一種細(xì)胞毒性物質(zhì)，可選擇性地抑制細(xì)胞呼吸鏈 NADH 脫氫酶(即復(fù)合物I，complex I)的活性，使NADH氧化為NAD的過程受阻，減少ATP生成，阻礙質(zhì)子傳遞，細(xì)胞中活性氧的含量進(jìn)而增加，導(dǎo)致自由基過量累積，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5-6]。

Apelin最初是從牛胃組織中分離出來的。Apelin-13、apelin-17和apelin-36是apelin前體肽經(jīng)水解生成的生物活性形式。越來越多的證據(jù)表明，apelin可能在PD模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用[7-8]。

本實驗用魚藤酮刺激SH-SY5Y細(xì)胞，制作PD體外模型，然后用apelin-36干預(yù)，研究apelin-36的神經(jīng)保護(hù)作用及對線粒體功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SH-SY5Y細(xì)胞)購自美國菌種保藏中心(ATCC)；DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)；魚藤酮(美國Sigma公司)；Apelin-36(美國Phoenix Pharmaceuticals公司)；CCK-8(日本Dojindo公司)；Hoechst 33342檢測試劑盒(日本Dojindo公司)；線粒體復(fù)合物 I(complex I)ELISA 試劑盒(酶免),ADP/ATP比率檢測試劑盒(日本Dojindo公司)；RIPA裂解液(碧云天公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(天根生物公司)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(萬類生物公司)；α-synuclein抗體、bcl-2抗體、Bax抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；β-actin抗體(北京中杉金橋有限公司)。

1.1.2儀器 微量移液器(德國 Eppendorf公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；臺式低溫高速離心機(jī)(美國Beckman公司)；超聲波細(xì)胞粉碎儀(江蘇波場智能科技股份有限公司)；普通光學(xué)顯微鏡、倒置生物顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；激光共聚焦掃描顯微鏡(SP8)(德國 Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 U/ml)。將SH-SY5Y細(xì)胞接種于96、12或6孔板在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至約90%后，后續(xù)根據(jù)需要加入魚藤酮和apelin-36。

1.2.2藥物處理及分組 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，以5×104/孔的密度接種于96、12或6孔板中，隨機(jī)分成4組：對照組、apelin-36組、魚藤酮組、apelin-36+魚藤酮組，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至約90%，apelin-36組、apelin-36+魚藤酮組先給予apelin-36(10-6M)預(yù)處理，其他兩組加入相同劑量的PBS，魚藤酮組、apelin-36+魚藤酮組2h后給予魚藤酮(500 μM)處理，其他兩組加入相同劑量PBS，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，然后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3細(xì)胞活力測定 用CCK-8法測定細(xì)胞活力。首先將SH-SY5Y細(xì)胞以5×104/孔的密度接種在96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞長至約90%，按上述方法進(jìn)行藥物處理。繼續(xù)培養(yǎng)約22h后，加入CCK-8溶液(10μl/孔)，避光繼續(xù)孵育2h。最后在酶標(biāo)儀450nm處測量吸光度值。每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗平行重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測 將SH-SY5Y細(xì)胞以5×104/孔的密度接種于12孔板的蓋玻片上，細(xì)胞長至約90%，后按上述方法藥物處理。繼續(xù)培養(yǎng)約22h后，用PBS沖洗細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定20min，然后用PBS清洗3次。隨后，加入5mg/ml的Hoechst 33342，避光在室溫下放置15min，再用PBS沖洗兩次。染色細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下成像。每組選擇3張照片，計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.2.5線粒體復(fù)合物-I(complex I)檢測 SH-SY5Y細(xì)胞以5×104/孔的密度接種在6孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞長至約90%，然后按上述方法進(jìn)行藥物處理。繼續(xù)培養(yǎng)約22h后，去除上清液，按照人Complex I ELISA試劑盒的說明進(jìn)行操作。

1.2.6ADP/ATP比率檢測 SH-SY5Y細(xì)胞以5×104/孔的密度接種在白色96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞長至約90%，后按上述方法藥物處理。繼續(xù)培養(yǎng)約22h后，按照ADP/ATP比率檢測試劑盒說明操作。

1.2.7相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 Western blotting用于檢測Bax、bcl-2、α-synuclein的表達(dá)，β-actin作為對照。方法如下：按上述方法處理細(xì)胞，然后將SH-SY5Y細(xì)胞中提取的等量蛋白質(zhì)(30μg)加載到10% SDS-PAGE上，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下，用含5%無脂奶粉的TBST(含1%吐溫20的TBS緩沖液)封閉膜1h，然后在4℃與一抗孵育過夜。然后用TBST清膜3次，在室溫下與二抗(1:5000)孵育1h。最后加入ECL溶液，暗室內(nèi)曝光顯影。實驗平行重復(fù)3次，用ImageJ軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Apelin-36對魚藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

魚藤酮(500μM)降低了SH-SY5Y細(xì)胞存活率，而apelin-36(10-6M)預(yù)處理減輕了魚藤酮的神經(jīng)毒性并提高細(xì)胞活力。表明apelin-36對魚藤酮誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞存在一定的保護(hù)作用。見圖1。

注：***P<0.001 vs.對照組；###P<0.001 vs.魚藤酮組

2.2 Apelin-36對魚藤酮處理的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33342染色結(jié)果(圖2A)顯示，與魚藤酮組相比，apelin-36減輕了魚藤酮引起的細(xì)胞凋亡，并顯著降低了細(xì)胞凋亡率(圖2B)。

注：***P<0.001 vs.對照組；###P<0.001 vs.魚藤酮組。

2.3 Apelin-36對魚藤酮誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞中bcl-2、Bax和α-synuclein表達(dá)的影響

與對照組相比較，魚藤酮組bcl-2的表達(dá)顯著降低，Bax的表達(dá)顯著增加；而apelin-36+魚藤酮組與魚藤酮組相比，apelin-36則明顯上調(diào)了bcl-2的表達(dá)，減少了Bax的表達(dá)(圖3A)。魚藤酮組bcl-2/Bax的比值與對照組相比明顯降低，而apelin-36+魚藤酮組與魚藤酮組相比，bcl-2/Bax的比值明顯升高，說明apelin-36減輕了魚藤酮造成的細(xì)胞凋亡(圖3B)。與對照組相比，魚藤酮組α-synuclein的表達(dá)顯著增加，而apelin-36+魚藤酮組與魚藤酮組相比，apelin-36明顯減少了α-synuclein的表達(dá)(圖3C、3D)。

注：**P<0.01 vs.對照組；#P<0.05 vs.魚藤酮組；##P<0.01 vs.魚藤酮組

2.4 Apelin-36對魚藤酮誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞中complex I和ADP/ATP的影響

與對照組相比，魚藤酮組complex I的表達(dá)下調(diào)，ADP/ATP比率顯著上調(diào)；而與魚藤酮組相比，apelin-36和魚藤酮共處理組逆轉(zhuǎn)了這種現(xiàn)象。見圖4。

注：***P<0.001 vs對照組；###P<0.001 vs魚藤酮組；##P<0.01 vs 魚藤酮組

3 討論

線粒體是有氧呼吸發(fā)生的主要場所，除了為細(xì)胞提供能量外，線粒體還參與了細(xì)胞信息傳遞、細(xì)胞分化、和細(xì)胞凋亡等過程，而且擁有調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的能力[9]。研究顯示錯誤折疊的α-synulein的過度累積導(dǎo)致了神經(jīng)退行性變，而線粒體功能障礙參與了錯誤折疊的α-synulein累積這一過程[10-11]。

魚藤酮是一種可直接透過細(xì)胞膜和血腦屏障的細(xì)胞毒性物質(zhì)。線粒體complex I可被魚藤酮選擇性地阻斷，從而使NADH的氧化過程受阻，ATP生成減少，細(xì)胞中活性氧族增加，進(jìn)而自由基增加，進(jìn)一步導(dǎo)致氧化應(yīng)激[12]，最終引起細(xì)胞凋亡。因此魚藤酮可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能障礙，引起細(xì)胞凋亡。在本實驗中，與對照組相比，魚藤酮組α-synulein表達(dá)明顯升高，bcl-2/Bax比值明顯降低，細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡顯著增多。Bcl-2家族蛋白是典型的凋亡相關(guān)蛋白，可操控線粒體的外膜通透性。促凋亡蛋白Bax 可與抗凋亡蛋白bcl-2結(jié)合形成調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的異二聚體，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，bcl-2/Bax比率降低[13]。與魚藤酮組相比，apelin-36和魚藤酮共處理組中α-synulein的表達(dá)明顯降低，說明apelin-36預(yù)處理可減少錯誤折疊的α-synulein累積；同時，apelin-36和魚藤酮共處理組中bcl-2/Bax比率明顯升高，細(xì)胞活力顯著升高，細(xì)胞凋亡則明顯減少，說明apelin-36預(yù)處理可減少細(xì)胞凋亡，因此apelin-36可減輕魚藤酮對SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用，對神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

魚藤酮通過阻斷complex I造成了ATP生成減少，而ATP的生成減少降低了線粒體膜電位(ΔΨm)，導(dǎo)致線粒體膜的通透性改變，引起了線粒體功能紊亂[14-15]。本研究首次在魚藤酮PD體外模型中通過檢測線粒體complex I的表達(dá)和ADP/ATP的比率，來討論apelin-36是否可以減輕魚藤酮造成的線粒體功能紊亂。與對照組相比，魚藤酮組complex I的表達(dá)明顯降低，而ADP/ATP的比率顯著升高，這說明魚藤酮造成了線粒體功能紊亂。與魚藤酮組相比，apelin-36和魚藤酮共處理組complex I的表達(dá)明顯升高，而ADP/ATP的比率顯著降低，說明apelin-36可以減輕魚藤酮造成的線粒體功能紊亂。

綜上所述，apelin-36可以減輕魚藤酮造成的線粒體功能紊亂，減少錯誤折疊的α-synulein累積，提高細(xì)胞活力，減少細(xì)胞凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用。而apelin-36通過何種信號傳導(dǎo)途徑減輕魚藤酮造成的線粒體功能紊亂還不清楚，值得進(jìn)一步研究，為apelin成為治療PD的潛在臨床藥物提供新的證據(jù)。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。