超高效液相色譜法測定祛瘀生新膠囊膠囊中人參皂苷Rg1、Rb1及Re①

鄧松岳，蔣俊春，王偉麗

(商丘市食品藥品檢驗檢測中心，河南 商丘 476000)

祛瘀生新膠囊主要成分包括黃芪、丹參、黨參、山藥、土茯苓、當歸、三棱、莪術、肉桂、白術，具有活血止痛，軟堅散結的功效[1]，適用于多種原因引起的行走困難、屈伸活動受限、髖部腫脹、疼痛等功能障礙性疾病[2,3]。本研究以其中人參皂苷Rg1、Rb1及Re3種有效成分為含量測定指標，建立超高效液相色譜法測定祛瘀生新膠囊中人參皂苷含量，為該制劑的質(zhì)量評價提供參考。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

祛瘀生新膠囊(吉林龍鑫藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字Z20026010，批號：20191001、20191002、20191015、20190822、20190826、20190828，規(guī)格0.4g/粒)；人參皂苷Rg1對照品批號110754-201920，純度92.4%，人參皂苷Rb1對照品批號110703-201915，純度91.2%，人參皂苷Re對照品批號110704-201912，純度93.4%，均購買于中國食品藥品鑒定研究院，陰性對照品由醫(yī)院制劑室提供，乙腈為色譜純，水為純化水系統(tǒng)所制超純水，其他試劑為分析純。

1.2 儀器

日本島津公司生產(chǎn)的LC-20A型超高效液相色譜儀，廣東固特超聲有限公司生產(chǎn)的VGT-2120QTD型超聲清洗儀，上海梅特勒-托利多儀器有限公司提供的Sartorius CPA 225D型電子分析天平(精度0.01mg)。

2 方法

2.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODSⅡ型色譜柱(2.6μm，150mm×150mm)；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：甲醇，梯度洗脫：0～10min采用40%～95%流動相A洗脫，10～20min采用5%～40%流動相A洗脫,20～22min采用5%流動相A洗脫。進樣量5μL，流速0.25ml/min，柱溫30℃，檢驗波長203nm。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液制備：精密稱取人參皂苷Rg1對照品16.32mg、人參皂苷Rb1對照品16.68mg、人參皂苷Re對照品11.20mg，置于50mL容量瓶中，甲醇定容后搖勻，制成混合對照品溶液[4](人參皂苷Rg1濃度為199.88μg/mL、人參皂苷Rb1濃度為264.20μg/mL、人參皂苷Re濃度為141.52μg/mL)。

供試品溶液制備： 取待測樣本，于研缽中研細，精密稱定5g樣品置于錐形瓶中，加入100mL甲醇，超聲提取30min，冷卻至室溫后過濾，取75mL濾液蒸干，加30mL水溶解殘渣，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，水飽和正丁醇提取20min，提3次，合并正丁醇萃取液，用40mL氨試液、40mL水飽和正丁醇洗滌2次，正丁醇夜蒸干，加甲醇溶解殘渣，移至10ml容量瓶，甲醇定容后得到供試品溶液[5]。取陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制備得到陰性對照品溶液。

2.3 方法考察

適用性試驗[6]：分別取5μL混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液，注入超高效液相色譜儀，結果顯示，人參皂苷Rg1、Rb1、Re理論板數(shù)均大于3000，基線分離良好(分離度>1.5)。

線性關系考察：精密量取1μL混合對照品溶液進行測定，觀察峰面積，得到人參皂苷Rg1、Rb1、Re線性回歸方程，分析線性關系。

精密度試驗：取混合對照品進樣測定，紀錄峰面積，根據(jù)人參皂苷Rg1、Rb1、Re峰面積的RSD判斷

該方法精密度；穩(wěn)定性試驗：取不同時間(0、2、4、6、8、16h)的供試品溶液進行測定，紀錄峰面積，根據(jù)峰面積的RSD判斷供試品溶液穩(wěn)定性；重復性試驗：精密稱取樣品，制備6份供試品溶液，進樣測定，紀錄峰面積，根據(jù)峰面積的RSD判斷該方法重復性[7]。加樣回收試驗：取6份已知含量樣品，2.5g/份，分別加入人參皂苷Rg1、Rb1、Re對照品，制備供試品溶液進樣測定，紀錄峰面積，計算回收率。樣品含量測定：取適量樣品，精密稱定后制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積，計算樣品含量。

3 結果

3.1 線性關系

人參皂苷Rg1、Rb1、Re線性回歸方程分別為Y1=6.1765X1+49.831，Y2=4.5831X2+66.234，Y3=3.6498X3+80.236(r>0.9950)；結果顯示，人參皂苷Rg1、Rb1、Re質(zhì)量濃度分別在19.85～186.73μg/mL、25.39～261.40μg/mL、16.02～142.48μg/mL范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關系。

3.2 人參皂苷Rg1、Rb1、Re回收率、精密度、重復性、穩(wěn)定性

人參皂苷Rg1、Rb1、Re精密度在0.8%～1.3%，表明儀器精密度良好，穩(wěn)定性在1.2%～1.6%，表明供試品溶液室溫條件下穩(wěn)定性良好，重復性在1.8%～2.1%，表明該方法重復性良好，三種成分回收率在96.10%～99.45%，符合要求。見表1。

表1 人參皂苷Rg1、Rb1、Re回收率、精密度、重復性、穩(wěn)定性

3.3 樣品含量

3種成分中人參皂苷Rb1含量最少，人參皂苷Re含量最多。見表2。

表2 樣品含量測定結果(mg/g)

4 討論

超高效液相色譜是將小顆粒填料應用在高效液相色譜法上，結合高靈敏度檢測器和超高壓輸液泵發(fā)展而來的一種色譜技術，具有節(jié)約(流動相試劑消耗少)、環(huán)保、分離度高、效率高等優(yōu)點，能夠同時分析多種成分，且進樣量少，靈敏度高，也適用于分析低組分含量[8]。祛瘀生新膠囊成分較復雜，人參皂苷為主要有效成分，采用超高效液相色譜法。

本研究中采用Shim-pack XR-ODSⅡ型色譜柱(2.6μm，150mm×150mm)，該色譜柱填料為高強度硅膠顆粒，對極性分子具有較強的反相保留能力，人參皂苷Rg1、Rb1、Re均為極性分子，能夠獲得較好的分離效果[9]。人參皂苷Rg1可快速緩解疲勞、改善學習記憶、延緩衰老，具有興奮中樞神經(jīng)作用、抑制血小板凝集作用，人參皂苷Rb1具有增強膽堿系統(tǒng)的功能，增加乙酰膽堿的合成和釋放以及改善記憶力作用，人參皂苷Re能抑制中樞神經(jīng)，促進DNA，RNA合成，有升高血漿皮質(zhì)酮、擴張血管的作用[10]。故可將人參皂苷Rg1、Rb1、Re作為祛瘀生新膠囊質(zhì)量控制的指標性成分。為去除祛瘀生新膠囊中的干擾成分，本研究采用回流提取和超聲提取，優(yōu)化供試品制備中樣品超聲提取時間、氨洗滌用量和次數(shù)、正丁醇提取用量和次數(shù)等步驟，使處理方法更加簡便且結果準確。通過對數(shù)種洗脫系統(tǒng)進行預實驗，最終選擇0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相，洗脫效果較理想。

綜上，高效液相色譜法測定祛瘀生新膠囊膠囊中人參皂苷Rg1、Rb1及Re含量簡便可靠，重復性、穩(wěn)定性好，精密度高，可作為該制劑中人參皂苷檢測方法。