網(wǎng)果酸模提取工藝優(yōu)化及其提取物對幽門結扎大鼠胃酸胃蛋白酶的影響?

王瑞海， 許 京， 劉麗梅， 苗 青， 嚴光俊， 郭昌洪， 蔣學斌△

(1.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所， 北京 100700；2.湖北省荊州市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 荊州 434000)

胃炎是一種急性或慢性彌漫性或局限性的胃壁膨脹[1]，由多種因素引起，包括幽門螺桿菌感染、阿司匹林等藥物誘導、非甾體抗炎藥、皮質(zhì)類固醇和酒精攝入[2]。胃炎最常見的癥狀包括上腹痛、胃灼熱、惡心和嘔吐[3]。在眾多致病因素中，幽門螺桿菌感染是其主要原因[4]，研究證實其與上消化道疾病密切相關[5]。對于幽門螺桿菌感染，臨床通常采用三聯(lián)療法[6]，盡管目前的治療方法可以緩解胃炎的一些主要癥狀，但新耐藥幽門螺桿菌菌株的出現(xiàn)[7，8]，同時治療藥物引發(fā)了一系列嚴重的副作用[9]，因此仍然有必要尋找新的、安全的預防策略。中醫(yī)藥是一種綜合性醫(yī)療體系，對亞洲人的健康維護起著重要作用，由于其可靠的療效和較少的副作用[10，11]，為預防和治療胃炎等復雜疾病提供了廣闊的前景。

網(wǎng)果酸模(RumexchalepensisMill.)為地方(湖北荊州)常用草藥，具有清熱解毒、通便、殺蟲等功效，民間用于止血和治療痢疾[12]。網(wǎng)果酸模中含有的酸模素具有很強的抗真菌(白色念珠菌、紅色發(fā)癬菌)活性[13,1415]，大黃素、大黃酚等蒽醌類化合物對幽門螺桿菌均有較強的抑制生長作用[16-171819]，但其提取工藝未經(jīng)過優(yōu)化，抑制幽門螺桿菌活性未見報道。因此，本文以大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、酸模素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的總提取率及抑菌(幽門螺桿菌)環(huán)為指標，優(yōu)化網(wǎng)果酸模提取工藝，為其提高臨床療效提供科學依據(jù)。本研究通過中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所倫理委員會審查(批號2019-054)。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量200±20 g，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供，許可證號SCXK(京)2016-0002。自由飲水攝食，人工光照，12 h的明暗周期，室內(nèi)溫度控制在21～24 ℃，空氣流通。

1.2 藥物

奧美拉唑腸溶膠囊(修正藥業(yè)集團長春高新制藥公司，批號180310)。

1.3 主要試劑及儀器

胃蛋白酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A080-1-1)；大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品(成都埃法生物科技有限公司，批號AF8032001)；大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品、酸模素對照品、大黃素對照品、大黃酚對照品、大黃素甲醚對照品(成都普思科技股份有限公司，批號分別為PS010712、PS170608-03、PS000259、PS010475、PS000263)；幽門螺桿菌SS1株(上海市消化疾病研究所，批號ATCC43504)；哥倫比亞血平板(法國科瑪嘉，批號181015)。藥材采集于湖北省荊州市，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學王振月教授鑒定為蓼科酸模屬植物網(wǎng)果酸模RumexchalepensisMill.干燥的根及根莖。

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Agilent Extend-C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)(美國安捷倫公司)；HW SY11-K電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器表公司)；98-1-B電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；ICH110培養(yǎng)箱(德國美墨爾特有限公司)；1300A2生物安全柜(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

2 方法

2.1 提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 對照品溶液的制備[20]精密稱取大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、酸模素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品適量，精密加入甲醇配制濃度為500 μg/mL的對照品儲備液。精密吸取上述各成分對照品儲備液適量，得到含上述各成分的濃度為21.7、49.8、18.7、6.1、9.9及13.3 μg/mL混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備[21]取干膏粉適量置于具塞三角瓶中，加甲醇40 mL稱重，超聲提取1 h放置至室溫，甲醇補足減失重量，搖勻、靜置，取上清液，過0.45 μm濾膜即得。

2.1.3 含量測定[12]采用Agilent Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，柱溫設定為25 ℃。以水(含0.1%甲酸)(A)-甲醇(B)為流動相，梯度洗脫程序為0～14 min，55%～40%A；14～25 min，40%～14%A；25～30 min，14%～0%A，分析時間35 min，流速為1 mL/min，檢測波長為254 nm。

2.1.4 抑菌活性實驗[22，23]將活化后的幽門螺桿菌接種至6%血清的布氏肉湯中，置于37 ℃搖床微需氧培養(yǎng)3～4 d，調(diào)至菌懸液菌濃度為107～108CFU/mL，用玻璃涂布棒均勻涂至哥倫比亞血平板上，室溫放置15 min待表面干燥后，將自制網(wǎng)果酸模不同提取工藝藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，置于微需氧培養(yǎng)袋中，37 ℃微需氧培養(yǎng)3 d，用游標卡尺量取完整抑菌圈直徑。

2.1.5 指標成分測定[13]以網(wǎng)果酸模大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、酸模素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷的總提取率和不同提取工藝提取物抑菌環(huán)直徑為指標，測定提取工藝提取物各成分含量，計算各成分提取率。參照文獻測定抑菌環(huán)直徑，提取率公式如下：網(wǎng)果酸模大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6個成分總提取率(%)=提取物中大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6個成分質(zhì)量和÷藥材質(zhì)量×100%[7]。

2.1.6 網(wǎng)果酸模水提取L9(34)正交試驗 經(jīng)相關文獻調(diào)研和多次預實驗，選擇提取時間、料液比、提取次數(shù)為考察因素(見表1)。以抑制幽門螺桿菌抑菌環(huán)直徑、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6個成分的總提取率為考核指標，采用L9(34)正交實驗法進行實驗設計。

表1 網(wǎng)果酸模水提取工藝因素和水平

2.1.7 網(wǎng)果酸模醇提取L9(34)正交實驗 采用抑制幽門螺桿菌抑菌環(huán)直徑、大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6個成分的總提取率為考核指標，以乙醇濃度、提取時間、料液比、提取次數(shù)為考察因素，正交設計因素水平(見表2)。按L9(34)正交實驗法對網(wǎng)果酸模進行醇提取工藝的優(yōu)選。

表2 網(wǎng)果酸模醇提取工藝因素水平表

2.2 網(wǎng)果酸模對幽門結扎大鼠胃酸胃蛋白酶的影響

2.2.1 動物分組 大鼠適應性喂養(yǎng)3 d隨機將SD大鼠分為模型組(C)、陽性藥奧美拉唑組0.018 g/kg(omeprazole)、中西藥聯(lián)合給藥組(奧美拉唑組0.018 g/kg +網(wǎng)果酸模提取物0.780 g/kg，OH)、網(wǎng)果酸模提取物高劑量組0.780 g/kg(H)、網(wǎng)果酸模提取物中劑量組0.390 g/kg(M)、網(wǎng)果酸模提取物低劑量組(L)0.185 g/kg。

2.2.2 造模[24-27]與取材 按文獻方法建立幽門結扎大鼠胃損傷模型[28]，末次給藥前12 h禁食，自由飲水，末次給藥后大鼠給予麻醉處理，減去腹部毛常規(guī)消毒，于劍突下沿腹白線開一長約3 cm的切口，小心提起胃，在幽門和十二指腸結合處結扎，縫合傷口后消毒送回籠中，術后禁食禁水，5 h后用麻醉處死動物，開腹結扎賁門取出全胃，倒出胃內(nèi)容物，離心后取上清液記錄胃液總量，留作胃液總酸度及每小時總酸排出量測定。以生理鹽水沖洗大鼠全胃，-80 ℃存放，用于胃組織蛋白酶活力的檢測。

2.2.3 總酸度[20]、總酸排出量、胃組織蛋白酶活力的測定 采用酸堿滴定法進行總酸度、總酸排出量的測定。依據(jù)下列公式計算總酸度、總酸排出量：總酸度 =NaOH濃度×NaOH消耗體積/胃酸體積，每小時總酸排出量=總酸度×胃液量/5。采用ELISA法按試劑盒說明書步驟檢測胃組織蛋白酶活力。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 網(wǎng)果酸模提取工藝優(yōu)化

3.1.1 網(wǎng)果酸模水提取工藝 以抑菌環(huán)為考察指標，各因素對水提取工藝影響順序為提取次數(shù)>提取時間>料液比；以大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6個成分的總提取率為考察指標，各因素對水提取工藝影響順序為提取次數(shù)>提取時間>料液比，2個考察指標中各因素對提取工藝影響順序一致。方差分析結果表明，提取次數(shù)對大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6個成分的總提取率有顯著影響(P<0.05)。結合實際生產(chǎn)的成本，確定網(wǎng)果酸模最佳水提取工藝為藥材加12倍量水，煎煮90 min提取3次。按優(yōu)選的最佳工藝提取3批樣品進行驗證實驗，依法測得網(wǎng)果酸模出膏率分別為41.28%、43.61%和40.53%，大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6個成分的總含量分別為0.92%、0.88%、0.91%，提取率分別為0.38%、0.38%和0.37%，平均提取率為0.38%。

3.1.2 網(wǎng)果酸模水提醇沉工藝考察 按優(yōu)選的最佳工藝提取5批樣品濾過合并藥液，靜置沉淀濃縮，加乙醇分別醇沉至含醇量為55%、60%、65%、70%、75%，過夜離心30 min，回收溶劑減壓干燥，計算出膏率。測定水提醇沉提取物中大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6個成分含量，計算提取率、轉移率。結果表明，隨醇沉濃度的增加，網(wǎng)果酸模中大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6個成分總提取率及轉移率呈先升后降趨勢，抑菌環(huán)直徑呈先上升后平緩趨勢，醇沉濃度為65%時，大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6個成分總提取率及轉移率最高為0.28%及33.08%，同時抑菌環(huán)直徑為12 mm，因此，選取醇沉至含醇濃度為65%進行醇沉。對上述網(wǎng)果酸模水提醇沉工藝進行驗證，3批樣品的總提取率分別為0.28%、0.27%和0.27%。

3.1.3 網(wǎng)果酸模醇提取工藝 2個考核指標各因素對醇提取工藝影響順序均為乙醇濃度>提取時間>料液比>提取次數(shù)，對網(wǎng)果酸模醇提取影響順序一致。最佳提取工藝為6倍量75%乙醇回流提取90 min，提取3次。方差分析結果顯示，4個因素對網(wǎng)果酸模網(wǎng)果酸模醇提取工藝無顯著影響。按優(yōu)選的最佳工藝提取3批樣品進行驗證實驗，出膏率分別為23.6%、23.1%和22.8%，大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6個成分的總含量分別為3.13%、3.14%、3.13%，提取率分別為0.74%、0.73%和0.73%，平均提取率為0.73%，轉移率分別為85.59%、84.05%和82.69%，平均轉移率為84.11%。

3.1.4 網(wǎng)果酸模最佳水提取工藝、水提醇沉工藝、醇提取工藝參數(shù)對比 對比最佳水提取工藝、水提醇沉工藝、醇提取工藝、出膏率、6個成分總含量、總提取率及轉移率參數(shù)對比(見表3)。結果表明，醇提取工藝出膏率較低，大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6個成分總提取率和轉移率最高(見圖1)，空白組紙片附近有菌落、無抑菌環(huán)，與空白組相比網(wǎng)果酸模各工藝提取物均有抑菌作用，醇提取工藝抑菌環(huán)較大，因此網(wǎng)果酸模應采用75%乙醇提取。

表3 網(wǎng)果酸模3種工藝參數(shù)比較

A. 空白組； B. 水提工藝組； C. 水提醇沉工藝組； D. 醇提工藝組圖1 網(wǎng)果酸模藥敏試驗

3.2 幽門結扎大鼠胃液量、總酸度、總酸排出量、胃組織蛋白酶活力

圖2示，網(wǎng)果酸模提取物可以抑制幽門結扎大鼠胃液、胃酸的釋放，降低胃組織中蛋白酶活力的趨勢，其中高劑量組具有顯著性，整體呈現(xiàn)劑量依賴性。網(wǎng)果酸模聯(lián)合奧美拉唑可以極顯著地抑制大鼠胃液的釋放(P<0.001)，顯著抑制胃酸排放(P<0.05)以及降低胃蛋白酶活力(P<0.01)，優(yōu)于奧美拉唑、網(wǎng)果酸模單獨給藥。

注: 與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；C：模型組；omeprazole：奧美拉唑組；OH：奧美拉唑組聯(lián)合網(wǎng)果酸模高劑量組；H：網(wǎng)果酸模高劑量組，M：網(wǎng)果酸模中劑量組；L：網(wǎng)果酸模低劑量組; A. 胃液量； B. 總酸度； C. 總酸排出量； D. 胃組織蛋白酶活力圖2 幽門結扎大鼠胃液量、總酸度、總酸排出量及胃組織蛋白酶活力比較

4 討論

網(wǎng)果酸模顆粒劑為湖北省中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，已有30多年的臨床應用基礎，主要用于治療幽門螺桿菌感染等相關性胃炎，其制劑采用水提醇沉工藝，未經(jīng)嚴格的優(yōu)化，因此有必要對其提取工藝進行科學優(yōu)化。2017年，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構公布幽門螺桿菌為一類致癌物[29，30]。據(jù)報道，全球約75%的胃癌病例和5.5%的惡性腫瘤可能歸因于幽門螺桿菌引起的炎癥和損傷[31，32]。本文對網(wǎng)果酸模提取工藝進行正交設計，將可能影響其有效成分的因素納入考察范圍，同時對網(wǎng)果酸模中的主要成分進行含量測定，以更加科學合理地控制其質(zhì)量。此外，加以體外抑菌作為考察指標，更加貼近臨床，本研究可為網(wǎng)果酸模的臨床應用和質(zhì)量控制提供技術支撐。

本實驗采用正交實驗設計，設計方法成熟。實驗結果表明，網(wǎng)果酸模不同工藝所得提取物均具有抑制幽門螺桿菌的作用。同時數(shù)據(jù)顯示，網(wǎng)果酸模提取物中大黃素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷等6個成分總提取率的高低與其抑菌環(huán)的直徑大小呈正相關，因此，驗證實驗及3種工藝比較6個成分提取率即可，同時推斷酸模素及大黃素等6種成分可能為網(wǎng)果酸模治療幽門螺桿菌相關性胃炎的主要有效成分。

胃液由胃黏膜中的壁細胞、主細胞和黏液細胞分泌組成，是消化道重要的消化液，主要成分是胃酸。胃蛋白酶由胃內(nèi)胃蛋白酶原經(jīng)過胃酸活化后產(chǎn)生，胃蛋白酶的活性隨胃酸分泌增多而增強并誘發(fā)自身消化，造成胃黏膜損傷，促進潰瘍形成。研究結果表明，網(wǎng)果酸模通過抑制胃酸胃蛋白酶的釋放，對胃黏膜起到保護作用，聯(lián)合奧美拉唑抑制效果更佳，起到質(zhì)子泵抑制劑的作用。

綜上所述，網(wǎng)果酸模最佳提取工藝為6倍量的75%乙醇回流，提取3次，每次90 min。該工藝穩(wěn)定可行，網(wǎng)果酸模提取物可顯著抑制胃酸、胃蛋白酶的釋放，為網(wǎng)果酸模的制劑開發(fā)、臨床應用提供科學依據(jù)，為進一步闡明其作用機制奠定基礎。