青蒿鱉甲湯合西北燥證經(jīng)驗(yàn)方對(duì)陰虛內(nèi)燥型圍絕經(jīng)期焦慮大鼠的影響?

劉愛玲， 馬 麗， 周 光△

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)， 烏魯木齊 830011；2.中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所， 烏魯木齊 830011)

圍絕經(jīng)期焦慮癥是指初次發(fā)病于圍絕經(jīng)期，以焦慮不安、精力缺乏為主要癥狀的疾病，屬于情感性精神障礙。圍絕經(jīng)期婦女因腎氣漸衰、天癸將竭、沖任虛損、精血不足而致陰陽失調(diào)。女性多郁易怒，且受生物因素、社會(huì)環(huán)境等影響，出現(xiàn)煩躁易怒、驚恐不安、睡眠差等一系列精神障礙，從而導(dǎo)致焦慮癥的發(fā)生[1]。圍絕經(jīng)期焦慮癥的發(fā)病率是絕經(jīng)前期的2～2.5倍[2，3]。新疆地區(qū)圍絕經(jīng)期相關(guān)病證研究顯示，中醫(yī)證型以陰虛內(nèi)燥為主，并有其地域特點(diǎn)[4]。青蒿鱉甲湯合西北燥證經(jīng)驗(yàn)方由青蒿、鱉甲、生地黃、知母、牡丹皮、桑椹、玫瑰花組成，具有養(yǎng)陰透熱之功效，臨床常用于改善陰虛內(nèi)熱。本研究就青蒿鱉甲湯合西北燥證經(jīng)驗(yàn)方對(duì)陰虛內(nèi)燥型圍絕經(jīng)期焦慮大鼠模型的影響展開研究，以探究其作用機(jī)制。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)20140304-136)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量149.7 g～206.5 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)室，溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%,光照節(jié)律12 L∶12 D。

1.2 藥物及制備

青蒿鱉甲湯合西北燥證經(jīng)驗(yàn)方藥物組成：青蒿、知母各6 g，牡丹皮、桑椹、玫瑰花各9 g，生地黃12 g，鱉甲15 g，每劑飲片常規(guī)煎煮2次，煎液合并過濾、混合后濃縮至含生藥量0.6 g/mL，每日1次，煎煮器具及標(biāo)準(zhǔn)一致，冷卻至室溫備用。經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中藥師凱麗比努爾·阿力甫鑒定藥材質(zhì)量合格。熱性造模劑由附子、干姜各75 g組成，常規(guī)煎煮2次，煎液合并過濾、混合后濃縮至含生藥量1 g/mL，每日1次，冷卻至室溫備用(藥物來源及制作標(biāo)準(zhǔn)同上)；丁螺環(huán)酮片，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字(H19991024)；“五三粉”飼料由五香粉250 g、辣椒粉150 g、胡椒粉50 g、花椒粉50 g組成，購自新疆笑廚食品有限公司，貨號(hào)(20171227)，放入50 kg大鼠普通飼料中，制備成1%比例的“五三粉”飼料。

1.3 主要試劑及儀器

血清腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF,貨號(hào)JL12910)、雌二醇(estradiol，E2，貨號(hào)JL11473)、孕酮(progesterone，PROG,貨號(hào)JL15546)、促黃體激素(luteinizing hormone，LH,貨號(hào)JL21049)、催乳素(prolactin，PRL,貨號(hào)JL12505)、睪酮(testosterone，T,貨號(hào)JL11473)、血清促卵泡素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH,貨號(hào)JL13251)、Elisa檢測試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)。

MPA6型多功能皮膚測試儀，德國CK公司；自制高架十字迷宮(elevated plus-maze，EPM，開放臂：50 cm，閉合臂：50 cm，臂高：30 cm，離地高度：45 cm)；GX-500A型陶瓷煎藥壺，潮州市潮安區(qū)東鳳廣興五金燃具廠；Multiskam GO1510型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.4 分組與造模

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、陰虛內(nèi)燥型圍絕經(jīng)期焦慮組(模型組)、青蒿鱉甲湯合西北燥證經(jīng)驗(yàn)方組(中藥組)、丁螺環(huán)酮片組(西藥組)，每組各10只。

1.4.1 圍絕經(jīng)期大鼠模型的建立 參照文獻(xiàn)采用“去卵巢模型”造模方法[5]，實(shí)驗(yàn)第1天各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，除假手術(shù)組外，其余大鼠手術(shù)結(jié)扎卵巢下輸卵管并切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后第5天開始，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，連續(xù)5 d未見動(dòng)情周期樣改變則提示造模成功。

1.4.2 陰虛內(nèi)燥型圍絕經(jīng)期大鼠模型的建立 除假手術(shù)組外，其余大鼠在術(shù)后第10天開始灌服熱性中藥造模劑10 mL/(kg·d)，并飼喂“五三粉”飼料，不限食，保持安靜，連續(xù)灌胃、飼喂4周。大鼠呈現(xiàn)舌尖色紅，口唇干燥脫皮，大便干，皮膚角質(zhì)層含水量下降，體質(zhì)量增長緩慢，則提示陰虛內(nèi)燥型圍絕經(jīng)期大鼠模型造模成功。

1.4.3 陰虛內(nèi)燥型圍絕經(jīng)期焦慮大鼠模型的建立 參照文獻(xiàn)采用“不確定空瓶應(yīng)激法”[6]，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠實(shí)驗(yàn)第10天在灌胃熱性中藥和飼喂“五三粉”飼料的同時(shí)，開始每天僅在10∶30～10∶40 和 19∶00～19∶10給水，1周后在此飲水時(shí)間段內(nèi)各組無規(guī)律地給予24 h空瓶飲水刺激，連續(xù)3周。結(jié)束后采用高架十字迷宮試驗(yàn) (elevated plus-maze,EPM)評(píng)價(jià)模型焦慮程度，建立陰虛內(nèi)燥型圍絕經(jīng)期焦慮大鼠模型。

1.5 給藥方法

實(shí)驗(yàn)第38天造模結(jié)束后次日，經(jīng)口灌胃給予假手術(shù)組、模型組動(dòng)物蒸餾水，中藥組青蒿鱉甲湯合西北燥證經(jīng)驗(yàn)方(5.94 g生藥/kg)，西藥組丁螺環(huán)酮片(1.8 mg/kg，按體表面積換算)，各給藥組的給藥體積均為10 mL/(kg·d)，連續(xù)治療14 d后停藥。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 一般情況 觀察動(dòng)物毛色、排泄物、口唇皮膚黏膜、舌色并及時(shí)進(jìn)行記錄，每周1次。

1.6.2 體質(zhì)量檢測 雌鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后稱重為造模前體質(zhì)量，術(shù)后10 d開始每周定期稱重并記錄。

1.6.3 皮膚角質(zhì)層含水量測定 大鼠背部剃毛2 cm×2 cm，將MPA6多功能皮膚測試儀水分測試探頭垂直地輕壓在被測皮膚表面，測量并記錄皮膚角質(zhì)層含水量，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后檢測記錄為造模前皮膚角質(zhì)層含水量，陰虛內(nèi)燥型圍絕經(jīng)期焦慮大鼠造模成功時(shí)檢測記錄為造模后皮膚角質(zhì)層含水量。

1.6.4 陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢測 用拇指和食指捏住雌鼠尾巴，其余3指輕壓雌鼠后腰背部，提起尾巴露出陰道口，用移液器吸取100 μL 0.9%氯化鈉溶液，滴入大鼠陰道吹打數(shù)次，后吸出陰道內(nèi)液體，制備陰道脫落細(xì)胞涂片，固定后行甲苯胺藍(lán)染色，術(shù)后第5天開始每天1次，連續(xù)5 d。

1.6.5 高架十字迷宮試驗(yàn) 在末次給藥后，各組動(dòng)物進(jìn)行EPM測試[7]。測試前將大鼠提前5 min單獨(dú)放置在一個(gè)白色盒中適應(yīng)新環(huán)境，隨后將大鼠放置于EPM架的中央，使其頭部朝向開放臂的一側(cè)，釋放后記錄大鼠5 min內(nèi)進(jìn)入開放臂次數(shù)、開放臂停留時(shí)間、進(jìn)入閉臂次數(shù)和閉臂停留時(shí)間。

1.6.6 Elisa法測定血清BDNF及性激素含量 末次給藥結(jié)束后麻醉各組動(dòng)物，腹主動(dòng)脈采集3～5 mL全血，離心取上清液保存于-80 ℃，Elisa法檢測大鼠血清BDNF、E2、FSH、T、PRL、LH、PROG含量，操作嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況、體質(zhì)量及皮膚角質(zhì)層含水量觀察結(jié)果

表1示，與假手術(shù)組比較，造模結(jié)束后大鼠毛色色暗，舌尖紅，口唇偏干，大便干結(jié)。造模前各組大鼠皮膚角質(zhì)層含水量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后與假手術(shù)組比較，模型組皮膚角質(zhì)層含水量均顯著下降(P<0.01)。造模前各組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，造模后與假手術(shù)組比較，模型組體質(zhì)量顯著下降(P<0.01)。

表1 各組大鼠皮膚角質(zhì)層含水量與體質(zhì)量變化比較

2.2 去勢造模后陰道脫落細(xì)胞涂片觀察結(jié)果

圖1示，假手術(shù)組大鼠動(dòng)情間期陰道內(nèi)以白細(xì)胞為主，動(dòng)情前期具有大量核上皮細(xì)胞和少數(shù)角化上皮細(xì)胞，動(dòng)情期以角化上皮細(xì)胞為主且偶見白細(xì)胞，動(dòng)情后期可見角質(zhì)化上皮細(xì)胞和白細(xì)胞，生殖道內(nèi)發(fā)生分解代謝和退化性改變。與假手術(shù)組大鼠比較，卵巢切除后第5天開始，連續(xù)5 d對(duì)動(dòng)物進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，未見有動(dòng)情周期的變化，說明大鼠去勢成功。

注：A.假手術(shù)組；B.圍絕經(jīng)期造模動(dòng)物；d1為第1天圖1 陰道脫落細(xì)胞涂片檢查結(jié)果比較(甲苯胺藍(lán)染色×100)

2.3 各組大鼠EPM行為學(xué)檢測結(jié)果比較

表2示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)明顯減少(P<0.05)，在開放臂停留時(shí)間明顯縮短(P<0.05)，進(jìn)入閉臂次數(shù)明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，中藥組進(jìn)入開放臂次數(shù)明顯增加(P<0.05)，在開放臂停留時(shí)間明顯延長(P<0.05)，進(jìn)入閉臂次數(shù)明顯減少(P<0.05)；西藥組進(jìn)入開放臂次數(shù)顯著增加(P<0.01)，在開放臂停留時(shí)間顯著延長(P<0.01)，進(jìn)入閉臂次數(shù)顯著減少(P<0.01)，在閉臂停留時(shí)間顯著縮短(P<0.01)。

表2 各組大鼠高架十字迷宮行為學(xué)檢測結(jié)果比較

2.4 各組大鼠血清BDNF及性激素6項(xiàng)含量比較

表3示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清BDNF、E2、T、PRL、PROG均顯著下降(P<0.01)，F(xiàn)SH、LH顯著上升(P<0.01)。與模型組比較，中藥組大鼠血清BDNF顯著上升(P<0.01)，PRL、PROG明顯上升(P<0.05)；西藥組大鼠血清BDNF、E2、PRL、PROG均顯著上升(P<0.01)，F(xiàn)SH、LH均顯著下降(P<0.01)。

表3 各組大鼠血清BDNF及性激素6項(xiàng)含量比較

3 討論

圍絕經(jīng)期是女性周期性生理改變的重要時(shí)期之一，也提示女性卵巢功能處于持續(xù)性衰退中[8]。女性從該時(shí)期起不再排卵，并會(huì)出現(xiàn)各種不同程度的植物神經(jīng)紊亂及內(nèi)分泌失調(diào)等癥狀。隨著性激素水平的不斷下降，會(huì)出現(xiàn)各種圍絕經(jīng)期生理、心理以及激素水平的改變直至絕經(jīng)。這一時(shí)期易出現(xiàn)失眠多夢(mèng)、潮熱、煩躁易怒等癥狀，尤其以焦慮等情感性精神障礙更為多見，可能會(huì)影響家庭和諧及社會(huì)安定。女性從青春期至絕經(jīng)后幾年一直處于焦慮癥高發(fā)階段，尤其是在45～54歲年齡段患病率最高，約為男性患病率的1.7～2.7倍[9]。因此，提高生活質(zhì)量成為廣大中老年女性的迫切訴求，關(guān)愛圍絕經(jīng)期女性身心健康也成為世界公共衛(wèi)生問題。

“西北燥證”是以口鼻、咽喉、肌膚干燥和干咳、煩躁等各種不適癥狀為特征的中醫(yī)證候，因其發(fā)生于西北地區(qū)，且以干燥癥狀為主，所以被稱為“西北燥證”。由于新疆特殊的地域氣候環(huán)境，“西北燥證”關(guān)聯(lián)生殖病證多發(fā)，尤其是女性月經(jīng)紊亂、月經(jīng)過少、閉經(jīng)等[10]。圍絕經(jīng)期焦慮癥屬于中醫(yī)“婦人臟躁”范疇，臟陰不足、五臟失養(yǎng)而情志異常。新疆圍絕經(jīng)期病證證型以陰虛內(nèi)燥證為主[11]，因此推測陰虛內(nèi)燥證可能也是新疆居民圍絕經(jīng)期焦慮癥的主要證型，“西北燥證”可能是新疆居民圍絕經(jīng)期焦慮癥臟陰不足、五臟失養(yǎng)、情志異常之陰虛內(nèi)燥證的主要背景因素。

青蒿鱉甲湯出自清·吳鞠通《溫病條辨》,由青蒿、鱉甲、細(xì)生地、知母、牡丹皮 5 味藥物組成。方中以鱉甲直入陰分，滋陰退熱；青蒿芳香清熱透絡(luò)，兩藥相配內(nèi)清外透，使陰分伏熱有外透之機(jī)。吳塘自釋：“此方有先入后出之妙，青蒿不能直入陰分，有鱉甲領(lǐng)之入也；鱉甲不能獨(dú)出陽分，有青蒿領(lǐng)之出也?！鄙攸S滋陰涼血；知母苦寒質(zhì)潤，滋陰降火，二者助鱉甲養(yǎng)陰退虛熱；牡丹皮泄血中伏火，以助青蒿清透陰分伏熱。方劑功用養(yǎng)陰透熱與圍絕經(jīng)期焦慮癥之陰虛內(nèi)熱證方證相應(yīng)；新疆名老中醫(yī)劉繼祖結(jié)合西北地域多燥特點(diǎn),認(rèn)為女性圍絕經(jīng)期病證是因腎精血不足、肝陰匱乏、肝陽上亢、心火獨(dú)旺而致的腎燥、肝燥等臟燥病。且燥多挾虛,其虛為本,其燥為標(biāo)。因地域之外燥者,其燥為病因，內(nèi)燥者其燥為病果,由此提出“虛燥論”的學(xué)術(shù)思想,以新疆地產(chǎn)中草藥桑椹、玫瑰花調(diào)補(bǔ)沖任、滋腎養(yǎng)肝、平肝安神、養(yǎng)血潤燥,為治療圍絕經(jīng)期臟燥病證經(jīng)驗(yàn)藥組[12]。本研究實(shí)驗(yàn)方劑配伍既體現(xiàn)出“方證相應(yīng)”的經(jīng)典辨證組方用藥規(guī)律，又遵循針對(duì)局域病證特點(diǎn)的臨證治療經(jīng)驗(yàn)。

本研究采用“五三粉”在圍絕經(jīng)期大鼠模型基礎(chǔ)上制備陰虛內(nèi)燥型圍絕經(jīng)期焦慮模型，與圍絕經(jīng)期模型組比較，陰虛內(nèi)燥型圍絕經(jīng)期焦慮組大鼠皮膚角質(zhì)層含水量明顯下降，性激素6項(xiàng)水平變化明顯，血清E2、T、PRL、PROG含量降低，F(xiàn)SH、LH含量升高。在給予青蒿鱉甲湯合西北燥證經(jīng)驗(yàn)方治療后，進(jìn)入開放臂的次數(shù)增加且時(shí)間延長，性激素6項(xiàng)水平改善優(yōu)于陰虛內(nèi)燥型圍絕經(jīng)期焦慮組。當(dāng)E2降低、FSH升高時(shí)，會(huì)引起下丘腦-垂體-卵巢軸功能失調(diào)，導(dǎo)致LH和FSH的進(jìn)一步增加，反射性抑制大腦皮質(zhì)功能出現(xiàn)自主神經(jīng)功能紊亂，從而引起包括圍絕經(jīng)期焦慮癥在內(nèi)的圍絕經(jīng)期綜合征及惡性循環(huán)。本研究結(jié)果顯示，青蒿鱉甲湯合西北燥證經(jīng)驗(yàn)方從改善陰虛內(nèi)燥入手，滋陰降火，疏肝解郁，方證對(duì)應(yīng)，顯示出明顯的抗焦慮作用。本研究可為進(jìn)一步開展陰虛內(nèi)燥型圍絕經(jīng)期焦慮癥適宜性防治方案研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。