痰瘀同治方的處方優(yōu)化及驗(yàn)證研究?

楊湘蕃， 張華敏， 唐丹麗， 李 想， 李盈盈， 吳浩南， 劉思鴻△

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)， 昆明 650500；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所， 北京 100700；3.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 北京 100700；4.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所， 北京 100700)

目前，中藥處方優(yōu)化方法多為撤藥和拆方，即將大處方拆分為多個小組合，隨后開展多次實(shí)驗(yàn)對比其療效，這需要經(jīng)過數(shù)十次甚至數(shù)百次的實(shí)驗(yàn)，花費(fèi)大量的時間和精力，故亟需尋找一種新的處方優(yōu)化方法。課題組前期研發(fā)了一種基于中醫(yī)“君臣佐使”理論的加權(quán)網(wǎng)絡(luò)模塊劃分優(yōu)化方法[1]，其以群體協(xié)同為核心開展網(wǎng)絡(luò)模塊劃分，同時參照中醫(yī)君臣佐使理論對藥理網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行加權(quán)處理，并提出了一種尋找網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點(diǎn)的方法。借助網(wǎng)絡(luò)的雙向性，可以從核心節(jié)點(diǎn)反推出核心藥物，從而實(shí)現(xiàn)處方優(yōu)化。

痰瘀同治方是課題組依據(jù)痰瘀同治法提出的臨床有效方，包含赤芍、瓜蔞等藥物。臨床實(shí)踐證明，痰瘀同治方是治療冠心病的有效方劑，具有活血化痰、通陽宣痹之效[2]。痰瘀同治方也是治療心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MI/RI)的有效中藥復(fù)方。前期研究證實(shí)，該方可通過降低炎癥因子、抑制自噬與凋亡和調(diào)節(jié)血脂代謝異常等多途徑起到保護(hù)心肌、改善MI/RI的作用[2-7]。但本方包含13味中藥，藥味繁多、成分復(fù)雜，難以清晰闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。因此，本文將采用基于中醫(yī)“君臣佐使”理論的加權(quán)網(wǎng)絡(luò)模塊劃分優(yōu)化方法對其進(jìn)行優(yōu)化，并通過對比心梗面積、心肌酶譜、氧化應(yīng)激、炎癥因子等指標(biāo)觀察優(yōu)化后的方劑與原方對MI/RI的作用，驗(yàn)證該優(yōu)化方法的有效性與可行性，為中藥復(fù)方優(yōu)化提供新思路和新方法。本研究通過中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查。

1 材料與方法

1.1 痰瘀同治方抗MI/RI“成分-靶點(diǎn)-疾病”的加權(quán)藥理網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用公開的中藥成分、靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)等各類組學(xué)數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建痰瘀同治方抗MI/RI的“成分-靶點(diǎn)-疾病”藥理網(wǎng)絡(luò)，在此基礎(chǔ)上根據(jù)君臣佐使理論對網(wǎng)絡(luò)的邊賦予權(quán)重(詳見前期研究)[1]。

1.2 以群體協(xié)同算法為核心的網(wǎng)絡(luò)模塊劃分方法

采用群體協(xié)同算法，以群體協(xié)同模塊度為目標(biāo)，進(jìn)行模塊識別和劃分，利用節(jié)點(diǎn)度中心性(degree centrality，DC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和自定義的加權(quán)接近中心性(weighted closeness centrality，WCC)尋找核心成分群(詳見前期研究)[1]。

1.3 藥物與動物

痰瘀同治方基礎(chǔ)方組成：藥物1～13。優(yōu)化方1組成：藥物1～6。優(yōu)化方2組成：藥物1～5，9，11(優(yōu)化方1和優(yōu)化方2優(yōu)化過程詳見后文)。中藥材購于北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司，并由其出具藥材產(chǎn)地及品質(zhì)鑒定證明。

SPF級雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量(200±20)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK-(京)2016-0006。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所動物房，自由攝取滅菌水及普通飼料，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(22±1)℃，濕度(55±5)%。

1.4 主要試劑與儀器

肌酸激酶(creatine kinase, CK，批號201041)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB, CK-MB，批號201011)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH，批號200801)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST，批號200801)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT，批號200951)檢測試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)Elisa檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司,批號Y19035697)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測試劑盒、BCA法蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號010620200831，042820200913)；腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α，批號218247-009)、白細(xì)胞介素(interleukin-1β, IL-1β)、IL-6(Elisa檢測試劑盒，賽默飛世爾科技中國有限公司，批號226593-006，219558-006)。

SynrgyH1型多功能酶標(biāo)儀，美國BioTek；Mikro 200 R型高速離心機(jī)，德國Hettich；日立7180型全自動生化分析儀，日本HITACHI；Precellys Evolution生物樣品均質(zhì)混勻系統(tǒng)，法國Bertin Technologies；ALC-V8型動物呼吸機(jī)，上海奧爾科特公司；RM6240系列多道生理信號采集處理系統(tǒng)，成都儀器廠。

1.5 分組與給藥

將80只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為假手術(shù)組、MI/RI模型組、基礎(chǔ)方組、優(yōu)化方1組及優(yōu)化方2組共5組各16只。各組藥物劑量按60 kg成人每日1劑原方用量換算出大鼠每日用量，分別濃縮成含生藥量1.2 g/mL、0.6 g/mL及0.76 g/mL的水煎液[8]，按14 g/(kg·d)、7.5 g/(kg·d)、9.42 g/(kg·d)的劑量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥3周。假手術(shù)組、MI/RI模型組大鼠按10 mL/kg灌服去離子水。

1.6 模型復(fù)制

動物模型的復(fù)制采用課題組前期造模方法[9]，大鼠用20%烏拉坦全身麻醉并仰臥位固定，四肢皮下插入電極并連接RM6240系列多道生理信號采集處理系統(tǒng)并記錄心電圖。大鼠頸部和左胸手術(shù)備皮并將氣管接入呼吸機(jī)(呼吸頻率80次/min，吸呼比1∶2，潮氣量8 mL/kg)，觀察大鼠呼吸狀態(tài)是否正常。胸骨左側(cè)第3～4肋間逐層打開胸腔，并用彎鑷撕開心包膜使心臟充分暴露，用6-0號縫合線在左心耳下2 mm處結(jié)扎，用粗棉線墊底結(jié)扎冠狀動脈左前降支30 min，后松開縫合線取出棉線再灌注2 h。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為缺血時局部心肌壁發(fā)紺、膨出，心電圖ST段明顯抬高或T波高聳。

1.7 標(biāo)本采集

模型復(fù)制結(jié)束后，打開腹腔，腹主動脈采血，-80 ℃留存血清。心臟灌流后剪取心臟，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8 指標(biāo)檢測

根據(jù)各指標(biāo)試劑盒說明書用全自動生化分析儀檢測大鼠血清AST、ALT、LDH、CK及CK-MB含量，或采用Elisa法檢測cTnI、IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.8.1 心肌組織中MDA含量檢測 按照MDA檢測試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在450 nm波長處用酶標(biāo)儀測定光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算后得出MDA含量。

1.8.2 心肌梗死面積檢測 取全心冷凍20 min后，沿冠狀位由前向后切片，厚度約為2 mm，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色，觀察心肌梗死情況，其中灰白色為梗死區(qū)，深紅色為非梗死區(qū)，最后用Image J圖像分析系統(tǒng)處理并計算心肌梗死面積比[10]。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 痰瘀同治方處方優(yōu)化結(jié)果

利用以群體協(xié)同為核心的模塊劃分方法，在加權(quán)網(wǎng)絡(luò)中共得到13個群體協(xié)同模塊[11]，排除模塊度在0.3以下和模塊中節(jié)點(diǎn)數(shù)目過少(<3)的模塊，共納入10個模塊進(jìn)行分析。圖1、2示，統(tǒng)計所有模塊中每個中藥的DC和CC值，發(fā)現(xiàn)DC值和CC值基本上分布比較平均，僅藥物9在模塊9里出現(xiàn)1個較大的DC值，提示藥物9或許在特定領(lǐng)域中對MI/RI起作用。

圖1 群體協(xié)同模塊中的DC值

圖2 群體協(xié)同模塊中的CC值

在加權(quán)網(wǎng)絡(luò)中，由于權(quán)重系數(shù)及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的原因，單純用經(jīng)過邊的數(shù)量難以反映2個點(diǎn)之間聯(lián)系的密切程度，于是提出用WCC從加權(quán)網(wǎng)絡(luò)的角度來判斷藥物的中心度，具體算法見前文[11]，WCC值越大說明節(jié)點(diǎn)在模塊中的重要性越高。圖3示，統(tǒng)計每個中藥在所有模塊中的WCC值，發(fā)現(xiàn)藥物1、藥物2、藥物3的值較大。然后在模塊度排名前5的5個模塊中，取WCC排名前3位的藥物得到核心藥物組合(藥物1～6)。同時也發(fā)現(xiàn)，這幾種藥物的DC值和CC值在模塊中排名靠前，說明這幾味藥物在網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位。

圖3 群體協(xié)同模塊中的WCC值

另一方面，對每個模塊進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，藥物6幾乎在所有的模塊都有出現(xiàn)，回溯發(fā)現(xiàn)或許是因?yàn)樗幬?的成分個數(shù)過多，約占總成分個數(shù)的20%(103/504)，考慮是否排除藥物6進(jìn)行驗(yàn)證。同時，觀察到特殊的模塊7，其成分個數(shù)大于等于3的藥物僅有藥物6、藥物9、藥物11，且藥物9在模塊9里出現(xiàn)1個非常大的DC值，提示藥物9和藥物11或許在特定領(lǐng)域中對MI/RI起作用。

因此，綜合考慮并擬定出優(yōu)化方1(藥物1～6)和優(yōu)化方2(藥物1～5,9,11)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2 優(yōu)化方1、優(yōu)化方2與原方藥效學(xué)比較研究

2.2.1 各組大鼠血清LDH、CK、CK-MB和cTnI表達(dá) 表1示，與假手術(shù)組比較，MI/RI模型組大鼠血清LDH、CK、CK-MB和cTnI的含量顯著升高(P<0.01)；與MI/RI模型組比較，基礎(chǔ)方組和優(yōu)化方1組血清LDH、CK、CK-MB和cTnI含量顯著下降(P<0.05，P<0.01)，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；優(yōu)化方2組血清LDH、CK、CK-MB和cTnI含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清LDH、CK、CK-MB與cTnI含量比較

2.2.2 各組大鼠血清AST和ALT表達(dá) 表2示，與假手術(shù)組比較，MI/RI模型組大鼠血清AST、ALT及其比值顯著升高(P<0.01)；與MI/RI模型組比較，基礎(chǔ)方組和優(yōu)化方1組血清AST、ALT及其比值顯著下降(P<0.05，P<0.01)，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，優(yōu)化方2組則僅有AST/ALT顯著下降(P<0.01)。

表2 各組大鼠血清AST、ALT和AST/ALT比較

2.2.3 各組大鼠心肌組織MDA表達(dá) 表3示，與假手術(shù)組比較，MI/RI模型組大鼠心肌MDA含量顯著升高(P<0.05)；與MI/RI模型組比較，基礎(chǔ)方組和優(yōu)化方1組心肌MDA含量顯著下降(P<0.05)，2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，優(yōu)化方2組變化比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠心肌MDA含量比較

2.2.4 各組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)比較 表4示，與假手術(shù)組比較，MI/RI模型組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高(P<0.01)；與MI/RI模型組比較，基礎(chǔ)方組血清IL-1β和TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，優(yōu)化方1組IL-1β、IL-6和TNF-α指標(biāo)含量均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，優(yōu)化方2組的IL-6和TNF-α含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

表4 各組大鼠血IL-1β、IL-6與TNF-α含量比較

2.2.5 各組大鼠心肌梗死面積 表5圖4示，與假手術(shù)組比較，MI/RI模型組大鼠心肌梗死面積顯著增加(P<0.01)；與MI/RI模型組比較，基礎(chǔ)方組、優(yōu)化方1組和優(yōu)化方2組心肌梗死面積均顯著減小(P<0.01)。

表5 各組大鼠心肌梗死面積比較

圖4 各組大鼠心肌梗死面積比較

3 討論

3.1 對痰瘀同治方的處方優(yōu)化

中藥處方優(yōu)化的目標(biāo)是形成藥味更簡但療效更優(yōu)或基本不變的新處方。目前最常用的處方優(yōu)化方法為撤藥分析法和拆方分析法。撤藥分析法即將復(fù)方中各個藥物輪流剔除并分組實(shí)驗(yàn)，用以判斷剔除的藥物對原本復(fù)方藥效和不良反應(yīng)的影響[11]。這種方法比較適合藥味較少的復(fù)方，如果藥味過大則需要進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，消耗大量的人力、物力，且容易產(chǎn)生較多的誤差。拆方分析則以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，按不同治法或君臣佐使的配伍關(guān)系，或藥物性味的不同，或“藥對”關(guān)系進(jìn)行拆方，分解為不同部分進(jìn)行研究[12]。這是最具中醫(yī)特色的一種研究方法，然而同撤藥分析法一樣，缺點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)次數(shù)過多，實(shí)驗(yàn)消耗大及所需時間較長。

隨著生物技術(shù)和信息科學(xué)的發(fā)展及不斷融合，基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等方面積累了大量的組學(xué)數(shù)據(jù)[13]。整合這些組學(xué)數(shù)據(jù)，可以構(gòu)建關(guān)于藥物、基因、疾病、靶點(diǎn)之間復(fù)雜的藥理網(wǎng)絡(luò)。借助藥理網(wǎng)絡(luò)分析，可以篩選中藥活性成分，闡述中藥或者方劑的作用機(jī)理、探討疾病的發(fā)病機(jī)制[14-16]。同時網(wǎng)絡(luò)具有雙向性，這給中藥處方優(yōu)化研究提供了新思路，通過構(gòu)建藥理網(wǎng)絡(luò)、篩選核心節(jié)點(diǎn)，可以反向篩選出核心藥物組合，從而大大減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，縮短實(shí)驗(yàn)時間，減少人力和物力支出。因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上[2-7]提出了一種新的處方優(yōu)化方法，借助藥理網(wǎng)絡(luò)分析篩選“成分-靶點(diǎn)-疾病”中的核心節(jié)點(diǎn)，得出核心成分群，從而擬定出優(yōu)化方。該方法首先聚焦在藥物間的協(xié)同作用上，以群體協(xié)同算法為核心，尋找網(wǎng)絡(luò)中群體與群體之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，而非個體與個體之間的關(guān)系。其次，當(dāng)前大多數(shù)學(xué)者在構(gòu)建藥理網(wǎng)絡(luò)時，將所有中藥在方劑中的藥效都做了均一性處理，故在網(wǎng)絡(luò)中不會體現(xiàn)出差別，將中醫(yī)君臣佐使方劑配伍理論引入到網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建中，能夠提高模塊劃分的質(zhì)量，從而也從側(cè)面證實(shí)了中醫(yī)“君臣佐使”思想對方劑藥理作用的影響。從整體上看，該方法與傳統(tǒng)方法相比能更清晰地發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和關(guān)系，從而能提取出更為準(zhǔn)確的藥物核心成分群，反推出核心藥物組合，實(shí)現(xiàn)中藥方劑的處方優(yōu)化。

基于以上方法，本研究在構(gòu)建痰瘀同治方抗心肌缺血再灌注的藥理網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，按照君臣佐使理論對網(wǎng)絡(luò)中的邊進(jìn)行加權(quán)，使用以群體協(xié)同計算為核心的方法進(jìn)行模塊劃分，得到13個群體協(xié)同模塊。結(jié)合模塊分析和加權(quán)中心性，分析模塊中的核心節(jié)點(diǎn)，得到核心成分群，最終反推出優(yōu)化方1和優(yōu)化方2。

3.2 優(yōu)化方的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，MI/RI的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前認(rèn)為其主要與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種病理生理變化有關(guān)[17]。

生理狀態(tài)下，絕大多數(shù)心肌酶和cTnI在細(xì)胞內(nèi)部維持正常的生理作用，但當(dāng)細(xì)胞受損后，心肌細(xì)胞膜通透性改變，心肌酶即釋放到血液中，血中的CK、LDH、AST等心肌酶就會升高，胞漿酶釋放量增加可反映細(xì)胞損傷嚴(yán)重。MDA為氧自由基與細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，常被作為氧自由基生成和造成膜損害的指標(biāo)[18]。cTnI是心肌組織的一種特有的調(diào)節(jié)蛋白，可作為敏感和特殊的心肌損傷標(biāo)志物[19]。本研究顯示，MI/RI模型組的CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、MDA和cTnI均顯著升高，同時心肌梗死面積顯著增加，提示此時心肌細(xì)胞嚴(yán)重受損。與MI/RI模型組比較，基礎(chǔ)方組及優(yōu)化方1組CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、MDA和cTnI均顯著降低，心梗面積顯著減??；優(yōu)化方2除心肌梗死面積顯著降低外，其他指標(biāo)均變化不明顯。結(jié)果提示，痰瘀同治方及優(yōu)化方1在抑制心肌酶釋放、抗氧化應(yīng)激及降低心肌梗死程度等方面對MI/RI具有較好的保護(hù)作用。

MI/RI引起心肌細(xì)胞內(nèi)源性的炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)釋放大量炎性因子，從而進(jìn)一步引起心肌受損[20]。TNF-α是啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因素，可誘導(dǎo)多種炎癥因子和黏附分子的產(chǎn)生；IL-6、IL-1β是關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子, 廣泛參與機(jī)體缺血缺氧、炎癥、應(yīng)激的調(diào)控，在急性心肌梗死過程中扮演著非常重要的角色[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，再灌注后MI/RI模型組TNF-α、IL-6及IL-1β均顯著升高。與MI/RI模型組比較，優(yōu)化方1組TNF-α、IL-6及IL-1β顯著降低，基礎(chǔ)方組TNF-α及IL-1β顯著降低，優(yōu)化方2組TNF-α、IL-6顯著降低，說明在MI/RI過程中3組均可減少炎癥因子的釋放，優(yōu)化方1可能效果更佳。動物實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)結(jié)果顯示，優(yōu)化方1組在抑制血清心肌酶釋放、抗氧化應(yīng)激、減輕炎癥因子方面顯示出較好的抗MI/RI作用，且效果與痰瘀同治方相當(dāng)。

綜上所述，本研究將基于中醫(yī)“君臣佐使”理論的加權(quán)網(wǎng)絡(luò)模塊劃分優(yōu)化方法應(yīng)用于痰瘀同治方的處方優(yōu)化研究中，篩選出優(yōu)化方1和優(yōu)化方2，并通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)優(yōu)化方1和原方療效相當(dāng)，證實(shí)該處方優(yōu)化方法的有效性和可能性，為中藥復(fù)方優(yōu)化提供了一種新思路和新方法。