秦皮甲素抑制人鼻咽癌細(xì)胞系HNE-3增殖

沈永華，汪峻峰，程澤星，馮娟娟

(揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，江蘇 揚(yáng)州 225001)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)是臨床常見的一種頭頸部惡性腫瘤，目前采用放射治療、化學(xué)藥物等方式治療鼻咽癌，但患者治療后的不良反應(yīng)大且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，因而尋找高效且安全的治療藥物或治療方式成為亟待解決的問題[1]。從植物中提取的有效活性成分具有抗氧化、抗腫瘤等作用，并可通過多途徑、多靶點(diǎn)等發(fā)揮作用，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究[2-4]。秦皮甲素(esculin)是從中藥秦皮中提取的有效成分，其具有抗腫瘤等作用，研究表明秦皮甲素可抑制肺癌細(xì)胞增殖[5]。但秦皮甲素與鼻咽癌相關(guān)研究尚未見報(bào)道。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是由外顯子和內(nèi)含子選擇性剪切形成的閉合環(huán)狀RNA分子，其不具有5′端帽子與3′尾巴結(jié)構(gòu)且不易被外切核酸酶降解，并可參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移及侵襲等生物學(xué)行為，研究表明circ-ZNF609在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)量升高，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[6]。但circ-ZNF609是否可作為鼻咽癌的治療靶點(diǎn)尚未闡明。因此，本研究旨在探討秦皮甲素是否可通過調(diào)控circ-ZNF609的表達(dá)而影響鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為，為鼻咽癌治療藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秦皮甲素(esculin)(中國(guó)食品藥品檢定研究院；批號(hào)：110756-201803)；人鼻咽癌細(xì)胞系HNE-3(上海賓穗生物科技有限公司)；熒光定量PCR試劑、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑(Thermo Fisher公司)；circ-ZNF609小分子干擾RNA(si-circ-ZNF609)及其陰性對(duì)照(si-NC)(廣州市銳博生物科技有限公司)；pcDNA、circ-ZNF609過表達(dá)載體(pcDNA-circ-ZNF609)(上海吉滿生物科技有限公司)；CCK-8試劑、Matrigel基質(zhì)膠、丙酮酸激酶、己糖激酶活性檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；Transwell小室(Corning公司)；葡萄糖攝取檢測(cè)試劑盒(AAT Bioquest公司)；兔抗人MMP-2、MMP-9與二抗(CST公司)；乳酸檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的處理及分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HNE-3細(xì)胞按每孔5×103個(gè)/100 μL接種96孔板(100 μL/孔)，分別加入含有不同濃度秦皮甲素(0.2、0.6、1.8 mmol/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h[7]，分別記為esculin-L組和esculin-M組、esculin-H組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的HNE-3細(xì)胞記為Ctrl組。按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將si-NC、si-circ-ZNF609轉(zhuǎn)染至HNE-3細(xì)胞，分別記為si-NC組、si-circ-ZNF609組。pcDNA、pcDNA-circ-ZNF609分別轉(zhuǎn)染至HNE-3細(xì)胞后加入含有1.8 mmol/L秦皮甲素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為esculin-H+pcDNA組、esculin-H+pcDNA-circ-ZNF609組。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：消化重懸各組HNE-3細(xì)胞，按照每孔3×104個(gè)/100 μL接種96孔板，加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A值)并計(jì)算細(xì)胞存活率[實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%]。

1.2.3 檢測(cè)葡萄糖攝取水平、乳酸水平與丙酮酸激酶、己糖激酶的活性：收集各組HNE-3細(xì)胞，按照葡萄糖攝取水平檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖攝取量，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，按照乳酸水平檢測(cè)試劑盒檢測(cè)乳酸含量。將各組HNE-3細(xì)胞按照每孔1×104個(gè)接種于12孔板，離心后棄上清，加入1 mL提取液，應(yīng)用超聲波破碎細(xì)胞，8 000×g，離心10 min，收集細(xì)胞上清后采用丙酮酸激酶、己糖激酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其活性。

1.2.4 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲：遷移實(shí)驗(yàn)：首先用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整各組HNE-3細(xì)胞為1×105個(gè)/mL單細(xì)胞懸液。按照100 μL/孔接種上室，下室接種600 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出小室，用多聚甲醛固定遷移細(xì)胞20 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，流水漂洗后晾干，于顯微鏡下計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)基與Matrigel基質(zhì)膠按照1∶6的比例充分混勻，分別在小室的上室加入100 μL稀釋液，培養(yǎng)箱內(nèi)凝固5 h備用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中circ-ZNF609的表達(dá)水平：用Trizol試劑分別提取各組HNE-3細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA濃度和純度合格后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書配置反應(yīng)體系與設(shè)置反應(yīng)條件進(jìn)行RT-qPCR。以2-ΔΔCt法計(jì)算circ-ZNF609(以GAPDH為內(nèi)參基因)相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 Western blot檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量:用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度，取40 μg蛋白加入樣品緩沖液，混勻后置沸水浴5 min，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉孵育2 h，分別與一抗MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)在4 ℃條件下孵育24 h，TBST洗膜后與二抗(1∶10 000)在室溫下孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)拍照，應(yīng)用ImageJ軟件測(cè)定各條帶相對(duì)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 秦皮甲素對(duì)HNE-3細(xì)胞糖酵解增殖的影響

Esculin-L組、esculin-M組、esculin-H組細(xì)胞存活率低于Ctrl組(P<0.001)，葡萄糖攝取水平和乳酸水平低于Ctrl組(P<0.001)，丙酮酸激酶和己糖激酶的活性低于Ctrl組(P<0.001)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表1)。

表1 秦皮甲素對(duì)HNE-3細(xì)胞增殖及糖酵解的影響Table 1 Effect of esculin on the proliferation and glycolysis of HNE-3 cells(x±s，n=9)

2.2 秦皮甲素對(duì)HNE-3細(xì)胞遷移及侵襲的影響

esculin-L組、esculin-M組、esculin-H組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)低于Ctrl組(P<0.001)，MMP-2、MMP-9蛋白水平低于Ctrl組(P<0.001)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1，表2)。

圖1 Western blot檢測(cè)秦皮甲素處理對(duì)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響Fig 1 Western blot detected effects of esculin treatment on the expression of MMP-2 and MMP-9 proteins

表2 秦皮甲素對(duì)HNE-3細(xì)胞遷移及侵襲的影響Table 2 The effect of esculin on HNE-3 cell migration and invasion(x±s，n=9)

2.3 秦皮甲素對(duì)HNE-3細(xì)胞中circ-ZNF609表達(dá)量的影響

與Ctrl組比較，esculin-L組、esculin-M組、esculin-H組circ-ZNF609的表達(dá)量降低(P<0.001)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表3)。

表3 秦皮甲素對(duì)HNE-3細(xì)胞中circ-ZNF609表達(dá)量的影響Table 3 Effect of esculin on the expression of circ-ZNF609 in HNE-3 cells(x±s，n=9)

2.4 干擾circ-ZNF609表達(dá)對(duì)HNE-3細(xì)胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲的影響

si-circ-ZNF609組細(xì)胞存活率低于si-NC組(P<0.001)，葡萄糖攝取水平和乳酸水平低于si-NC組(P<0.001)，丙酮酸激酶和己糖激酶的活性低于si-NC組(P<0.001)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)低于si-NC組(P<0.001)，MMP-2、MMP-9蛋白水平低于si-NC組(P<0.001)(圖2，表4)。

表4 干擾circ-ZNF609表達(dá)對(duì)HNE-3細(xì)胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲的影響Table 4 Effect of interference with circ-ZNF609 expression on the proliferation, glycolysis, migration and invasion of HNE-3 cells(x±s，n=9)

圖2 Western blot檢測(cè)干擾circ-ZNF609對(duì)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Western blot detected the effects of circ-ZNF609 interference on the expression of MMP-2 and MMP-9 proteins

2.5 circ-ZNF609過表達(dá)能夠推進(jìn)恢復(fù)秦皮甲素對(duì)HNE-3細(xì)胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲的抑制作用

esculin-H+pcDNA-circ-ZNF609組細(xì)胞存活率高于esculin-H+pcDNA組(P<0.001)，葡萄糖攝取水平和乳酸水平高于esculin-H+pcDNA組(P<0.001)，丙酮酸激酶和己糖激酶的活性高于esculin-H+pcDNA組(P<0.001)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)高于esculin-H+pcDNA組(P<0.001)，MMP-2、MMP-9蛋白水平高于esculin-H+pcDNA組(P<0.001)(圖3，表5)。

表5 circ-ZNF609過表達(dá)能夠恢復(fù)秦皮甲素對(duì)HNE-3細(xì)胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲的抑制作用Table 5 Over-expression of circ-ZNF609 could restore the inhibitory effects of esculin on the proliferation, glycolysis, migration and invasion of HNE-3 cells(x±s，n=9)

圖3 Western blot檢測(cè)circ-ZNF609過表達(dá)聯(lián)合秦皮甲素處理對(duì)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響Fig 3 Western blot detected the effects of circ-ZNF609 over-expression combined with cetin treatment on the expression of MMP-2 and MMP-9 proteins

3 討論

秦皮甲素可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)通路而抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖[8]。秦皮甲素可通過抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2的磷酸化水平而促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[9]。但秦皮甲素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系HNE-3生物學(xué)行為的影響尚未可知。本研究結(jié)果顯示，秦皮甲素能夠以濃度依賴性的方式降低HNE-3細(xì)胞存活率，提示秦皮甲素可抑制HNE-3細(xì)胞增殖。腫瘤發(fā)生發(fā)展與能量供應(yīng)密切相關(guān)，糖酵解途徑可供給腫瘤細(xì)胞能量，丙酮酸激酶、己糖激酶是糖酵解途徑中的主要激酶，抑制丙酮酸激酶、己糖激酶活性可促進(jìn)氧化磷酸化的發(fā)生從而加速癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，秦皮甲素可降低HNE-3細(xì)胞葡萄糖攝取水平和乳酸水平，還可降低丙酮酸激酶和己糖激酶的活性，且呈劑量依賴性，提示秦皮甲素可抑制HNE-3細(xì)胞糖酵解從而抑制細(xì)胞增殖。MMP-2、MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶，其在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)量升高并可促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[11]。本研究結(jié)果顯示，秦皮甲素處理后HNE-3細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，且呈劑量依賴性，提示秦皮甲素可抑制HNE-3細(xì)胞遷移及侵襲。但秦皮甲素調(diào)節(jié)HNE-3細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)，秦皮甲素能夠劑量依賴性地降低HNE-3細(xì)胞中circ-ZNF609的表達(dá)量，提示秦皮甲素可能通過抑制circ-ZNF609的表達(dá)而發(fā)揮抗鼻咽癌的作用。研究表明胃癌組織與細(xì)胞系中的circ-ZNF609水平升高，敲除circ-ZNF609可抑制細(xì)胞增殖及侵襲[12]。結(jié)直腸癌組織中circ-ZNF609呈高表達(dá)，抑制circ-ZNF609表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移[13]。circ-ZNF609在肺腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，抑制其表達(dá)可抑制肺腺癌細(xì)胞增殖[14]。本研究結(jié)果顯示，干擾circ-ZNF609表達(dá)后HNE-3細(xì)胞存活率降低，葡萄糖攝取水平和乳酸水平降低，丙酮酸激酶和己糖激酶的活性降低，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，而上調(diào)circ-ZNF609表達(dá)可逆轉(zhuǎn)秦皮甲素對(duì)HNE-3細(xì)胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲的抑制作用，提示秦皮甲素可通過抑制circ-ZNF609表達(dá)而抑制HNE-3細(xì)胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲。

綜上所述，秦皮甲素可抑制HNE-3細(xì)胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲，其作用機(jī)制與抑制circ-ZNF609的表達(dá)有關(guān)，circ-ZNF609可能作為秦皮甲素治療鼻咽癌的潛在靶點(diǎn)，circ-ZNF609在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中表現(xiàn)為癌基因的作用，可為鼻咽癌生物靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，還可為進(jìn)一步揭示秦皮甲素治療鼻咽癌的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。