miR-499通過靶向TGF-α抑制人骨肉瘤細(xì)胞系Saos2遷移和促凋亡

王 磊，邱明憲，張慧榮，張金萍，趙 靜，康 肖*，張清泉

(1.河北省衡水市第四人民醫(yī)院， 河北 衡水 053000； 2.河北省衡水市人民醫(yī)院， 河北 衡水 053000)

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是兒童、青少年較常見的高度惡性腫瘤[1]，近年來，隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，骨肉瘤的治療手段得到了一定提高，但是預(yù)后仍然差強(qiáng)人意，5年內(nèi)生存率低于30%[2]。其發(fā)病機(jī)制的分子機(jī)制也未得到充分的探討。

微小RNA(microRNA，miRNA)，其屬于內(nèi)源性的非編碼RNA，通過與目標(biāo)基因 mRNA 的3′-UTR 區(qū)域部分序列互補(bǔ)相結(jié)合，參與調(diào)控多種生物學(xué)進(jìn)程[3]。近年來miRNA功能調(diào)控為骨肉瘤治療提供了新的研究方向，在骨肉瘤發(fā)展過程中，已證實(shí)多種miRNA與其發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其中miRNA-206通過靶向Notch3抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移[4]；過表達(dá)miRNA-188-5p能明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖能力，阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)展[5]，多種miRNA已經(jīng)證實(shí)與骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，在這些miRNAs中，目前 miR-499在骨肉瘤惡性增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的確切生物學(xué)功能尚不清楚。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)作為表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)的配體，據(jù)報(bào)道TGF-α基因與許多類型的癌有關(guān)[6]。本研究初步證實(shí)了miR-499以及靶基因TGF-α對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的生物功能調(diào)控作用，揭示了miR-499作為抗癌因子在骨肉瘤中的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本及動(dòng)物：組織樣本采集自衡水市第四人民醫(yī)院經(jīng)病例確診的28例骨肉瘤手術(shù)患者手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本，研究中所有樣本均得到了本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020)倫審第(53)號(hào),并已取得了患者的知情同意；SPF級(jí)BALB/c裸鼠28只，4～9周，體質(zhì)量15～20 g。

1.1.2 試劑(盒)：人骨肉瘤細(xì)胞系(Saos2中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；RT-qPCR試劑盒、BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒、R轉(zhuǎn)錄試劑盒[自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；Transwell 小室(Coring公司)；TGF-α抗體、GAPDH抗體(內(nèi)參)、Ki67抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：使用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)人成骨肉瘤細(xì)胞系(Saos2)。轉(zhuǎn)染前24 h將增殖狀態(tài)良好的細(xì)胞接種密度按5×105個(gè)/孔接種于6孔板，隨后參照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 試劑說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)TGF-α的mRNA水平：使用Trizol從細(xì)胞系或組織中提取總RNA，總RNA經(jīng)R轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，其中U6為miR-499的表達(dá)水平的內(nèi)參，GAPDH為TGF-α的mRNA表達(dá)水平的內(nèi)參，參照RT-qPCR試劑盒制造商指示，進(jìn)行PCR反應(yīng)，RT-qPCR結(jié)果以2-△△Ct值形式得到。

1.2.3 Western blot檢測(cè)TGF-α蛋白：用放射免疫沉淀法緩沖液從組織或細(xì)胞中分離總蛋白，蛋白濃度采用BCA法檢測(cè)，等量(40 μg)提取的蛋白用10% SDS-PAGE分離，然后蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的奶粉(脫脂)于37 ℃封閉1 h。加入一抗TGF-α抗體(1∶500)，GAPDH抗體(1∶1 000)，其中GAPDH為內(nèi)參。4 ℃，過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，加入顯影劑1 min，然后使用ImageJ2X軟件進(jìn)行免疫印跡分析。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)： 通過TargetScan發(fā)現(xiàn)miR-499在TGF-α基因3’-UTR上的潛在結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建TGF-α野生型3′-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-TGF-α-wt和突變型報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-TGF-α-mut，將野生型或突變型報(bào)告基因質(zhì)粒與miR-NC、miR-499 mimic、NC-inhibitor或miR-499抑制劑共轉(zhuǎn)染進(jìn)Saos2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，測(cè)量各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)TGF-α蛋白： 將骨肉瘤組織和癌旁組織置于65 ℃烤片，梯度脫蠟、水化。進(jìn)行抗原修復(fù)。加入5%的正常羊血清封閉15 min。加入5%的正常羊血清封閉15 min。隨后加入一抗TGF-α抗體(1∶100)、Ki67抗體(1∶100)，4 ℃過夜。加二抗(1∶200)，37 ℃孵育30 min。采用DAB顯色后，蘇木精室溫復(fù)染2 min，而后進(jìn)行脫水和中性樹脂封片。采用正置顯微鏡觀察切片。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Saos2細(xì)胞遷移： 轉(zhuǎn)染后，收集各組細(xì)胞，Matrigel凝膠于4 ℃條件下過夜，將Saos2細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL。在上室加入100 μL細(xì)胞懸液；將含有10%的胎牛血清600 μL培養(yǎng)基添加到下室中；然后于恒溫箱中孵育24 h。將小室置于95%乙醇中固定 5 min；染色(0.5%結(jié)晶紫溶液)10 min后，用棉簽輕輕擦拭濾膜上層細(xì)胞后顯微鏡下觀察該膜下層細(xì)胞。

1.2.7 TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Saos2細(xì)胞凋亡： 在4%多聚甲醛中固定各組人成骨肉瘤細(xì)胞系Saos2細(xì)胞30～60 min，在0.3% H2O2中孵育(37 ℃，20 min)，采用PBS清洗3次后滴入50 μL的生物素標(biāo)記溶液，孵育(37 ℃下60 min)。結(jié)束后清洗(PBS)1次，滴加0.1～0.3 mL標(biāo)記反應(yīng)終止液，37 ℃，30 min，滴加DAB(0.2～0.5 mL)顯色液，蘇木精染色液染色細(xì)胞核。用95%乙醇脫水5 min，隨后于無水乙醇中脫水2次(3 min/次)，最后甲苯透明 2次(5 min/次)，顯微鏡下觀察切片。

1.2.8 構(gòu)建骨肉瘤裸鼠移植瘤模型： 將裸鼠隨機(jī)分為miR-NC組(n=7)，miR-499 mimic組(n=7)，NC-inhibitor組(n=7)和miR-499 inhibitor組(n=7)。Saos2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/mL，使用注射器向每只裸鼠右后肢腋部注射1×107個(gè)/只細(xì)胞懸液，21 d后腹腔注射水合氯醛麻醉(0.01 mL/g體質(zhì)量)并引頸脫臼處死裸鼠，從皮下去除其腫瘤組織及甲醛固定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所有數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗(yàn)，3組或3組以上的比較采用One-way Anova。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織中miR-499和TGF-α的表達(dá)水平差異

與癌旁組織相比，骨肉瘤組織中miR-499的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而TGF-α的mRNA表達(dá)則相反顯著升高(P<0.01)。TGF-α蛋白在骨肉瘤組織中蛋白表達(dá)和陽(yáng)性信號(hào)明顯高于癌旁正常組織(P<0.01)。TGF-α可能是miR-499的靶基因(P<0.01)。miR-499模擬物或抑制物轉(zhuǎn)染成功(P<0.01)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，pMIR-TGF-α-wt質(zhì)粒與miR-499模擬物共轉(zhuǎn)染進(jìn)Saos2細(xì)胞時(shí)，熒光素酶活性明顯降低。而轉(zhuǎn)染miR-499抑制物則能明顯增強(qiáng)pMIR-TGF-α-wt質(zhì)粒的熒光素酶活性(圖1)。

2.2 miR-499抑制TGF-α促進(jìn)Saos2細(xì)胞的生物學(xué)功能

TGF-α促進(jìn)了Saos2細(xì)胞遷移(P<0.01)，抑制細(xì)胞凋亡(P<0.01)，而miR-499模擬物則顯著抑制了Saos2細(xì)胞遷移(P<0.01)，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡(P<0.01)。共轉(zhuǎn)染miR-499+TGF-α后，細(xì)胞數(shù)量相比Saos2組有所降低，同時(shí)Saos2細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)(圖2)。

2.3 miR-499和TGF-α在骨肉瘤裸鼠移植瘤模型中的調(diào)控機(jī)制

miR-499過表達(dá)可下調(diào)TGF-α mRNA的蛋白表達(dá)，而miR-499抑制物則結(jié)果相反，增強(qiáng)TGF-α mRNA和蛋白的表達(dá)水平(圖3)。miR-499 模擬物組可明顯抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)且瘤中TGF-α的陽(yáng)性指標(biāo)顯著減少，而miR-499抑制劑可明顯促進(jìn)骨肉瘤的生長(zhǎng)且TGF-α的陽(yáng)性指標(biāo)顯著增加(圖4)。

3 討論

在骨肉瘤中miRNAs通過調(diào)控靶基因起到抑癌或者促癌作用[7]。與健康志愿者相比骨肉瘤患者血清中miR-411表達(dá)相對(duì)較高，并且上調(diào)miR-411可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖遷移[8]。另外一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)miR-646在骨肉瘤中發(fā)揮抑癌作用，同時(shí)過表達(dá)miR-646可以抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[9]。多項(xiàng)研究已經(jīng)探究了miRNA在骨肉瘤中的調(diào)控機(jī)制，本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-499在骨肉瘤組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，在以往的研究中，miR-499可以抑制肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞的侵襲和遷移[10]，但暫時(shí)尚未發(fā)現(xiàn)miR-499在骨肉瘤中的相關(guān)報(bào)道。

miRNAs根據(jù)其調(diào)控腫瘤中靶基因的不同，從而發(fā)揮促癌或抑癌作用，因此探究miR-499的潛在靶基因，是明確miR-499在骨肉瘤中的工作機(jī)制的重要環(huán)節(jié)[11]。本研究通過生信軟件發(fā)現(xiàn)miR-499在TGF-α的3′-UTR上具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)TGF-α是一種癌基因。并采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果也證實(shí)了TGF-α確為miR-499的靶基因，且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了miR-499能負(fù)調(diào)控TGF-α mRNA和蛋白表達(dá)水平。在骨肉瘤相關(guān)研究中TGF-α在骨肉瘤異常高表達(dá)并且受miRNA-376c調(diào)控[12]，這與本研究結(jié)果類似,本研究發(fā)現(xiàn)TGF-α可以促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞Saos2遷移能力并抑制凋亡率。

A，B.RT-qPCR was used to detect the expression of miR-499 and TGF-α mRNA in osteosarcoma and normal adjacent tissues; C.Western blot was used to detect TGF-α protein expression; D.TargetScan performs bioinformatics prediction; E.miR-499 was transfected; F.double luciferase reporter gene assay; G.the expression of TGF-α in tumor tissues was higher than that in normal adjacent tissues, the upper and lower figures show the positive expression of TGF-α in the tissues of different research subjects, and the positive degree is different. The percentage of TGFA antibody-positive cells in the lower figure is significantly higher, suggesting that the protein expression and positive signal of TGF-α in osteosarcoma tissues are enhanced；scale bar=20 μm; *P<0.01 compared with normal圖1 骨肉瘤組織中的表達(dá)變化Fig 1 Expression changes in osteosarcoma tissues

A.Transwell was used to detect the cell migration; B.UNEL assay was used to detect the apoptosis rate of cells;scale bar=200 μm; *P<0.01 compared with miR-NC圖2 miR-499/TGF-α軸對(duì)Saos2細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)控Fig 2 miR-499/TGF-α axis regulated the biological function of Saos2 cells

腫瘤的發(fā)生過程源于原癌基因激活以及抑癌基因突變，因此從細(xì)胞水平探究人骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移等惡性生物學(xué)行為，對(duì)于診斷以及控制癌細(xì)胞進(jìn)展有重要意義。因而本研究將進(jìn)一步深入探究miR-499在骨肉瘤中的作用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-499能有效的抑制骨肉瘤Saos2的遷移和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，而TGF-α則恰恰相反促進(jìn)了Saos2遷移能力和抑制了凋亡率，同時(shí)miR-499抑制TGF-α作為癌基因的調(diào)控作用，miR-499抑制了TGF-α的促進(jìn)遷移和抑制凋亡的作用，初步證實(shí)了miR-499通過負(fù)調(diào)控TGF-α在骨肉瘤中發(fā)揮抑制作用。

綜上所述，miR-499/TGF-α軸參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，抑制骨肉瘤Saos2細(xì)胞遷移和促進(jìn)凋亡，致力于為骨肉瘤診斷、治療提供新方向。

A，B.TGF-α mRNA expression was detected by RT-qPCR; C，D.expression of TGF-α protein was detected by Western blot；*P<0.01 compared with miR-NC圖3 miR-499/TGF-α軸的調(diào)控機(jī)制Fig 3 Regulatory mechanism of miR-499/TGF-α axis

A.tumor growth curve of each group; B.tumor weight of mice in each group; C.immunohistochemistry of osteosarcoma xenograft in nude mice; scale bar=200 μm, *P<0.01 compared with miR-NC圖4 miR-499 mimic和miR-499抑制劑對(duì)裸鼠移植骨肉瘤的影響Fig 4 Effects of mir-499 mimic and mir-499 inhibitor on osteosarcoma transplantation in nude mice