miR-223抑制肺結(jié)核大鼠肺部病變

童曉維，肖 韓

(宜昌市第三人民醫(yī)院 肺病科, 湖北 宜昌 443000)

肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PT)只由結(jié)核分枝桿菌引發(fā)的傳染性疾病，對(duì)人類的健康造成嚴(yán)重的危害。青壯年是PT的好發(fā)人群，中國結(jié)核病患者占全球的15%以上，也是結(jié)核病高發(fā)的國家之一[1]。結(jié)核分枝桿菌屬于一種寄生菌，當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染時(shí)會(huì)在巨噬細(xì)胞內(nèi)寄生，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌會(huì)在巨噬細(xì)胞凋亡后一起被清除。結(jié)核分枝桿菌感染人體一般通過呼吸道傳播，感染發(fā)生時(shí)，人體的細(xì)胞免疫功能會(huì)對(duì)機(jī)體進(jìn)行保護(hù)，因此有大部分的患者并不會(huì)發(fā)病[2]。在肌體細(xì)胞中，T細(xì)胞主導(dǎo)細(xì)胞免疫功能，巨噬細(xì)胞可有效反應(yīng)細(xì)胞中的免疫功能。干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)可有效的調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活化，白細(xì)胞介素-18(interleukin-18，IL-18)可以誘導(dǎo)IFN-γ大量的產(chǎn)生[3]。因此，猜測IFN-γ和IL-18介導(dǎo)著肺結(jié)核疾病的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。近年來，在很對(duì)真核細(xì)胞和病毒中均發(fā)現(xiàn)了微小RNA-miRNA，其主要是源自內(nèi)源性染色體的單鏈RNA。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的炎性反應(yīng)和免疫機(jī)制起到一定的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)對(duì)多種生物學(xué)活性均能進(jìn)行調(diào)節(jié)。近些年，隨著對(duì)miRNA的深入研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者體內(nèi)存在特異性miRNA表達(dá)[4]。高度保守的miR-223可調(diào)控炎性反應(yīng)，其機(jī)制可能是通過抑制其相關(guān)靶基因而實(shí)現(xiàn)[5]。有報(bào)道，miR-223在結(jié)核病患者的單核細(xì)胞中低表達(dá)，巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子可隨著miR-223的低表達(dá)而大量產(chǎn)生[6]。由此可見，在肺結(jié)核的機(jī)體免疫中miR-223起重要作用，但其具體的作用機(jī)制尚不明確，因此本文旨探究miR-223對(duì)肺結(jié)核大鼠肺部病變及IFN-γ蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠60只，清潔級(jí)，體質(zhì)量100～210 g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)[許可證號(hào)：SCXK(滬)1012-0002]。

1.2 試劑

結(jié)核分枝桿菌(青島綠谷商貿(mào)有限公司)；IL-18和IFN-γ ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；Trizol試劑(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司)；RT-qPCR檢測試劑盒(上海優(yōu)予生物科技有限公司)；引物序列、miR-223 mimics質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物的分組及處理：將大鼠分為正常組(NC組)；肺結(jié)核大鼠模型組(PT組)：經(jīng)大鼠尾靜脈注射0.2 mL結(jié)核分枝桿菌懸液；肺結(jié)核大鼠給予miR-223 mimics干預(yù)組(miR-223組)，每組10只。血液檢查及結(jié)核菌素試驗(yàn)證實(shí)肺結(jié)核建模成功后，miR-223組大鼠尾靜脈注射miR-223 mimics質(zhì)粒，2 mg/kg，3組大鼠均連續(xù)7 d。

1.3.2 樣本的收集：7 d后分別多次抽取大鼠尾靜脈血4 mL，分離血清，將血清置入到抗凝管中抗凝后保存用于后續(xù)試驗(yàn)。分別脫頸處死大鼠，取出肺組織后，保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測外周血T細(xì)胞亞群：用常規(guī)法檢測外周血T細(xì)胞免疫因子CD3+%、CD4+%、CD8+%的變化。

1.3.4 ELISA檢測血清中IFN-γ和IL-18的水平：用ELISA試劑盒檢測血清中IFN-γ和IL-18水平。

1.3.5 大鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落的計(jì)數(shù)：取肺組織50 mg，制備均漿組織，在組織液中加入4%硫酸消化組織，15 min后加入2.5 mol/L的NaOH，將pH值調(diào)至7.0左右，將組織接種于斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基溫度保持在37 ℃，5周后對(duì)培養(yǎng)基上的結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.6 HE染色觀察肺組織病理學(xué)形態(tài)：常規(guī)制備，HE染色后用顯微鏡觀察。

1.3.7 免疫組化檢測肺組織中IFN-γ蛋白表達(dá)：切片組織脫蠟，將抗原修復(fù)液加入到組織中，在98 ℃的環(huán)境下修復(fù)組織，15 min后清洗切片組織，用山羊血清將組織封閉，把IFN-γ蛋白一抗加入到組織中，在4 ℃環(huán)境中孵育過夜，次日PBS再次清洗組織，將生物素標(biāo)記的二抗加入到組織中，在37 ℃的環(huán)境中孵育，30 min后將DAB溶液滴加到組織內(nèi)將組織染色，用蘇木精將細(xì)胞核復(fù)染，將組織脫水透明后晾干，用中性樹膠將組織封片，顯微鏡下觀察組織中IFN-γ蛋白表達(dá)。

1.3.8 RT-qPCR檢測肺組織中miR-223、IFN-γ mRNA表達(dá)：用胰蛋白酶消化肺組織，Trizol法裂解后對(duì)總的RNA進(jìn)行提取，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。miR-223引物序列：上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTG GCTC-3′,下游引物5′-TGTCAGTTTGTCAAATACCC CA-3′；IFN-γ引物序列：上游引物5′-AGTTATATCT TGGCTTTTCA-3′，下游引物5′-TTCGACTGATTAAT AAGC-3′。反應(yīng)條件：分別在60 ℃、95 ℃環(huán)境下預(yù)變性10 min、30 s；在72 ℃環(huán)境下退火30 s；在95 ℃環(huán)境下延伸30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。miR-223、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 10.1軟件對(duì)NC組、PT組和miR-223組的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，3組間的數(shù)據(jù)比較用單因素方差法進(jìn)行檢驗(yàn)，兩組間比較采用LSD-t進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 外周血T細(xì)胞亞群變化的比較

和NC組相比，PT組大鼠外周血T細(xì)胞亞群CD3+%、CD4+%水平明顯降低，而CD8+%水平升高(P<0.05)；miR-223組大鼠外周血T細(xì)胞亞群CD3+%、CD4+%水平較PT組明顯回升，而CD8+%水平較PT組明顯回降(P<0.05)(表1，圖1)。

表1 各組大鼠外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的變化Table 1 Changes of CD3+、CD4+、CD8+ of T cell subsets in peripheral blood of rats in each group(x±s，%，n=10)

2.2 血清中IFN-γ和IL-18水平變化比較

和NC組大鼠血清中IFN-γ和IL-18水平比較，PT組顯著增加(P<0.05)；干預(yù)后的miR-223組大鼠血清中IFN-γ和IL-18水平較PT組顯著降低(P<0.05)(表2，圖2)。

表2 各組血清中IFN-γ和IL-18水平比較Table 2 Comparison of serum IFN-γ and IL-18 levels in each group(x±s，pg/mL，n=10)

2.3 肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)的比較

miR-223組大鼠肺組織中結(jié)核桿菌菌落數(shù)為(4.28±1.76/CFU)，低于PT組(9.33±2.15/CFU)(P<0.05)。

2.4 大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)比較

和正常的NC組相比，PT組肺組織細(xì)支氣管周圍有大量以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤；干預(yù)后的miR-223組大鼠肺組織得到明顯改善，較PT組肺組織細(xì)支氣管周圍炎細(xì)胞大量減少(圖1)。

圖1 大鼠肺組織病理形態(tài)HE染色Fig 1 HE staining of rat lung histopathology(×200)

2.5 大鼠肺組織中IFN-γ蛋白表達(dá)比較

和NC組相比較，PT組大鼠IFN-γ蛋白陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增加(P<0.05)；干預(yù)后的miR-223組大鼠IFN-γ蛋白陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)較PT組顯著降低(P<0.05)(圖2，表3)。

圖2 各組大鼠肺組織中IFN-γ蛋白表達(dá)免疫組化染色Fig 2 Immunohistochemical staining of IFN-γ protein expression in lung tissues of rats in each group(×200)

表3 各組大鼠肺組織中IFN-γ蛋白表達(dá)比較Table 3 Comparison of IFN-γ protein expression in lung tissue of rats in each group(x±s，n=10)

2.6 大鼠肺組織中miR-223、IFN-γ mRNA表達(dá)

和NC組大鼠肺組織中miR-223 mRNA表達(dá)相比較，PT組顯著降低；和NC組肺組織中IFN-γ mRNA表達(dá)相比較，PT組顯著升高(P<0.05)；干預(yù)后的miR-223組大鼠肺組織中miR-223 mRNA表達(dá)較PT組顯著增加，IFN-γ mRNA表達(dá)較PT組明顯降低(P<0.05)(表4)。

表4 各組大鼠肺組織中miR-223、IFN-γmRNA表達(dá)比較Table 4 Comparison of miR-223 and IFN-γ mRNA expression in lung tissue of rats in each group(x±s，n=10)

3 討論

肺結(jié)核屬傳染性呼吸系統(tǒng)疾病，當(dāng)機(jī)體被結(jié)核分枝桿菌感染后的2～3周，會(huì)出現(xiàn)免疫和遲發(fā)性的超敏反應(yīng)，讓細(xì)菌增殖受到免疫應(yīng)答抑制。研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核發(fā)病時(shí)，巨噬細(xì)胞中被大量炎性因子浸潤，因此調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫水平，抑制炎性反應(yīng)導(dǎo)致的肺組織損傷也是治療肺結(jié)核的重中之重[7]。miR-223表達(dá)于多種哺乳動(dòng)物中，其參與細(xì)胞增殖及組織生長[8]。miR-223可抑制肺結(jié)核患者體內(nèi)中性粒細(xì)胞趨化，減輕肺組織損傷[9]。

免疫功能低下是肺結(jié)核的主要發(fā)病機(jī)制，其中抗結(jié)核免疫中CD4+T細(xì)胞最為重要[10]。本研究結(jié)果顯示，PT組CD3+%、CD4+%降低，而CD8+%水平升高，miR-233干預(yù)后免疫應(yīng)答因子均改善，提示miR-233可增強(qiáng)肺結(jié)核大鼠機(jī)體內(nèi)免疫功能。機(jī)體內(nèi)活化的巨噬細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的IL-18，進(jìn)而誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力[11]。本文研究發(fā)現(xiàn)PT組IFN-γ和IL-18水平增多，miR-223干預(yù)后IFN-γ和IL-18表達(dá)回降，提示miR-223可通過抑制肺結(jié)核大鼠血清中IFN-γ和IL-18水平，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者血清中IL-18和IFN-γ水平升高，炎性因子增多，進(jìn)而加重了肺結(jié)核的免疫反應(yīng)[12]。miR-223可通過調(diào)控基因的表達(dá)進(jìn)而影響免疫細(xì)胞的發(fā)育和激活，并參與細(xì)胞的免疫反應(yīng)[13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PT組結(jié)核分枝桿菌的菌落數(shù)增加，miR-233組結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)明顯回降，提示miR-233可減少結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)數(shù)量，改善結(jié)核病的嚴(yán)重程度。研究發(fā)現(xiàn)，miR-223可減少肺結(jié)核大鼠肺組織中結(jié)核桿菌菌落數(shù)，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞的凋亡[14]。IFN-γ是肌酸激酶，可有效的激活巨噬細(xì)胞，進(jìn)而抵抗細(xì)胞內(nèi)感染的發(fā)生，機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌的殺傷力隨著IFN-γ的減少而降低。本研究發(fā)現(xiàn)，PT組IFN-γ表達(dá)增加，miR-223組中IFN-γ表達(dá)回降，提示miR-223可抑制肺結(jié)核大鼠肺組織中IFN-γ的表達(dá)，增加機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺傷作用，進(jìn)而改善結(jié)核病。嗜中性粒細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的致死性炎性可通過miR-233進(jìn)行抑制，進(jìn)而對(duì)白細(xì)胞的趨化作用進(jìn)行調(diào)節(jié)，介導(dǎo)肺結(jié)核及慢性炎性的發(fā)生發(fā)展。miR-223可抑制巨噬細(xì)胞中p65磷酸化，負(fù)向調(diào)節(jié)活化NF-κB，對(duì)體內(nèi)的細(xì)胞因子和巨噬細(xì)胞的凋亡進(jìn)行抑制，進(jìn)而抑制機(jī)體內(nèi)的抗結(jié)核免疫[15]。

綜上所述，過表達(dá)miR-223可抑制結(jié)核分枝桿菌引起的肺部炎性反應(yīng)，具有抗結(jié)核桿菌和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的雙重作用，同時(shí)還能有效抑制肺組織中IFN-γ的表達(dá)，進(jìn)而降低結(jié)核病的嚴(yán)重程度。