腸上皮Depdc5/mTORC1信號軸調控小鼠小腸上皮穩(wěn)態(tài)

張新格，馬 潔，王慶志，辛 悅，楊晨妍，熊熙文*

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院 1.法醫(yī)學院； 2.基礎醫(yī)學院 人體解剖與組織胚胎學系， 河南 新鄉(xiāng) 453000)

小腸上皮細胞(intestinal epithelial cells, IECs)為被覆于小腸黏膜表面各種不同類型的細胞組成的單層上皮細胞，這些細胞呈指狀突入腸腔形成絨毛，凹陷呈杯狀下陷深入間質形成隱窩[1]。隱窩基部少量腸道干細胞(intestinal stem cells，ISCs)分裂生成高度增殖的祖細胞，稱為短暫擴增(transit-amplifying，TA)細胞，其中分化為吸收細胞(柱狀細胞)、分泌細胞(例如杯狀細胞、簇細胞)沿著絨毛-隱窩軸向上遷移，調節(jié)營養(yǎng)攝取、消化與吸收；而分化為潘氏細胞遷移到隱窩底部，通過分泌防御素等多種抗菌物質，維持腸道微生物的平衡[2]。因此小腸上皮不僅是體內營養(yǎng)物質轉運的主要場所，在維持機體內穩(wěn)態(tài)和防止感染、炎性反應中起著至關重要的作用。

哺乳動物雷帕霉素靶標(mammalian target of rapamycin，mTOR)是磷脂酰肌醇激酶相關蛋白激酶家族中的一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有兩個不同的蛋白質復合物的催化亞基，分別稱為mTOR復合物1(mTORC1)和mTOR復合物2(mTORC2)[3]。NPRL2、NPRL3和DEPDC5共同形成的GATOR1復合物，是mTORC1信號通路的負向調節(jié)器[4-5]。 mTOR的匯聚和整合取決于營養(yǎng)、生長因子、能量和環(huán)境壓力對細胞的刺激信號，通過激活下游信號調節(jié)細胞增殖，影響胚胎干細胞和早期胚胎的發(fā)育，并且與腫瘤、癲癇、肥胖及代謝紊亂等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。Depdc5作為mTORC1上游的抑制基因[6]，抑制mTORC1的活性影響機體的代謝，Depdc5敲除介導的mTORC1激活對哺乳動物腸道上皮細胞的影響及調控機制目前尚不清楚。本研究通過用Cre-LoxP系統(tǒng)構建IECs特異性敲除mTORC1上游的抑制基因Depdc5的小鼠，探究Depdc5-mTORC1信號通路過度激活對腸上皮形態(tài)、功能、增殖、分化等方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：Depdc5floxed小鼠源于胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)細胞系，將其植入囊胚并通過假孕鼠繁育，獲取嵌合小鼠，再從嵌合小鼠通過基因鑒定，得到Depdc5floxed小鼠。本研究將Depdc5flox/flox小鼠與villin-Cre小鼠雜交，產生了Depdc5flox/flox：villin-Cre小鼠，簡稱IKO小鼠(圖1)。將Depdc5flox/flox小鼠作為對照組。通過提取小鼠尾巴組織的DNA進行基因型鑒定。實驗用鼠均飼養(yǎng)在SPF級動物房。動物實驗經新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物管理委員會審批后進行。

圖1 Depdc5flox/flox:Villin-Cre(IKO)小鼠構建Fig 1 Construction of Depdc5flox/flox:Villin-Cre (IKO)mouse

1.1.2 試劑：Actinin抗體(Proteintech公司)；PS6、S6抗體(CST公司)；DEPDC5、DCLK1、溶菌酶(Lysozyme)、Ki67抗體(Abcam公司)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；Prime ScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)和 SYBR? Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)(Vazyme Biotech公司)；山羊抗兔IgG/辣根酶標記(北京中杉金橋生物技術有限公司)；cDNA合成試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理： 將小鼠分為4組，5只/組，即對照組、IKO組、rap-Ctrl組、rap-IKO組。雷帕霉素(rapamycin) 5 mg(mTORC1的抑制劑)先充分溶解于10 mL DMSO中，再溶于10% PEG和10% Tween-80各1 mL的混合溶液中，以2 mg/kg的劑量通過腹腔注射給藥7 d。

1.2.2 Western blot檢測腸道組織DEPDC5、S6及PS6蛋白表達：小鼠禁食4 h(即上午9點禁食，13點取材)，分別取各組小鼠小腸及結腸組織2 cm研磨后提取蛋白并定量50 μg，在配置好的SDS-PAGE凝膠上分離，轉移到NC膜上。5% 脫脂牛奶在室溫中孵育1 h，條帶分別放入DEPDC5(1∶1 500)、PS6(1∶7 000)、S6(1∶3 000)、actinin(1∶4 000)一抗稀釋液中4 ℃孵育過夜。第2天用HRP偶聯(lián)的二抗(抗兔)室溫孵育1 h。洗滌后暗室曝光顯影。

1.2.3 RT-qPCR檢測小腸組織中Depdc5、Dclk1、Trpm5、Muc2的mRNA表達水平： 取0.5 cm小腸組織采用Trizol提取法提取組織總RNA。利用酶標儀在260 nm處吸光度法來測定RNA濃度，利用紫外分光光度計260/280 nm比值(1.8～2.0)來測定RNA的純度。使用cDNA合成試劑盒將提取出來的RNA反轉為cDNA。采用SYBR Green Master Mix在ABI Step One Plus實時熒光定量PCR系統(tǒng)中進行定量分析。按照如下條件上機：95 ℃，30 s；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s,40 個循環(huán)。最后使用 2-ΔΔCt方法計算表達水平的倍數變化。RT-qPCR反應所用具體引物見表1。

表1 RT-qPCR反應相關引物Table 1 RT-qPCR related gene primer sequence

1.2.4 免疫組化(immunohistochemical, IHC)染色檢測腸道上皮簇細胞、潘氏細胞、增殖細胞：小腸組織經 4 %多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，以DCLK1、溶菌酶、Ki67兔抗多克隆抗體作為一抗對標本進行免疫組織化學染色。以高壓鍋抗原修復，Triton X-100破膜后3%過氧化氫封閉。PBS漂洗5 min后，5%山羊血清封閉1 h，孵育DCLK1(1∶100)、溶菌酶(1∶800)、Ki67(1∶200)4 ℃過夜。第2天滴加山羊抗兔IgG/辣根酶標記二抗孵育1 h，DAB試劑顯色。在光學顯微鏡下分析并拍照，用Image J 軟件對簇細胞，潘氏細胞，增殖細胞進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 阿爾新藍染色檢測腸道上皮杯狀細胞：石蠟切片脫蠟、水化處理后，阿爾新藍及中性紅染色，脫水透明后封片。用Image J 軟件對杯狀細胞進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 蘇木精-伊紅染色(HE染色)檢測組織形態(tài)： 石蠟切片脫蠟、水化行HE染色后封片。用 Image J軟件對絨毛長度和隱窩深度進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用Graph Pad Prism軟件進行統(tǒng)計學分析，數據用均數±標準差(x±s)表示，兩兩比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 IECs特異性敲除Depdc5激活mTORC1信號通路

結果顯示(圖2A,B)，IKO組小鼠小腸、結腸組織中Depdc5的mRNA和蛋白表達均明顯低于對照組，并且IKO組小鼠小腸和結腸組織中mTOR信號通路下游靶點磷酸化S6(PS6)的蛋白表達明顯高于對照組(P<0.05)(圖2B)。

2.2 IKO組小鼠小腸上皮中簇細胞、潘氏細胞和杯狀細胞數量減少

IKO組小鼠小腸組織中Dclk1、Trpm5和Muc2的mRNA水平顯著低于對照組(P<0.05)(圖3A)。同時IHC結果顯示IKO小鼠IECs中簇細胞及潘氏細胞的細胞數量均減少約50% (P<0.05)(圖3B～C)，杯狀細胞數量減少約40% (P<0.05)(圖3D)。

A.mRNA level of Dclk1, Trpm5, Lysozyme and Muc2 detected by qPCR；B.number of clusters cells detected by IHC staining indicated by the arrow(×200)；C.number of Paneth cells detected by IHC staining indicated by the arrow(×400)；D.number of goblet cells detected by alcian blue staining dicated by the arrow(×200)；*P<0.05,**P<0.01 compared with control group圖3 Depdc5敲除后簇細胞、潘氏細胞和杯狀細胞數量減少Fig 3 Number of cluster cells, Paneth cells and goblet cells decreased after Depdc5 knockout(x±s,n=5)

A.mRNA level of Depdc5 was detected to evaluate the knockout efficiency in IECs； B.proten level of DEPDC5, PS6 and S6 detected by Western blot；*P<0.01, **P<0.001 compared with control group圖2 IECs中Depdc5敲除后mTORC1激活Fig 2 mTORC1 was over-activated after knocking out Depdc5 in IECs (x±s,n=5)

2.3 IKO組小鼠小腸上皮中增殖細胞數目增加

對照組小鼠及IKO組小鼠的小腸絨毛長度(villius height)無差異。IKO小鼠小腸隱窩的深度(crypt depth)較對照組顯著增加(P<0.05)(圖4A)。細胞增殖標志物Ki67的IHC染色顯示，IKO組小鼠隱窩中Ki67陽性細胞數量顯著增加(P<0.05)(圖4B)。

2.4 Rapamycin通過抑制mTORC1調控IECs的分化

rap-IKO組和rap-Ctrl組小鼠小腸組織中PS6的表達均較Ctrl組明顯下降(P<0.05)(圖5A)，且rap-IKO組小鼠和rap-Ctrl組小鼠小腸隱窩深度無顯著差異，兩組小鼠IECs中增殖細胞、簇細胞、潘氏細胞和杯狀細胞之間的數量差異也消失(圖5B～D)。

A.villus length (×200) and crypt depth (×400) detected by HE staining (marked by red line)； B.number of proliferating cells deteced by IHC staining (indicated by the arrow) (×400)；*P<0.05 compared with control group圖4 Depdc5調控細胞的增殖Fig 4 Depdc5 regulates cell proliferation(x±s, n=5)

3 討論

作為細胞內重要的能量感受蛋白，mTOR信號通路的長期過度活化可促進機體的異常代謝和細胞的異常增殖，因此mTOR信號通路過度激活與肥胖、胰島素抵抗等能量代謝性疾病及癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[7]。有報道指出高脂高膽固醇飲食、脂肪酸、氨基酸等能量物質均可過度激活IECs中的mTORC1信號通路進而促進IECs中脂滴形成、引起炎性反應、促進IECs的壞死性凋亡及癌變，提示各種外因引起的mTOR信號通路過度激活均可使IECs的生理功能發(fā)生紊亂[8-9]。Depdc5敲除介導的mTORC1信號通路過度活化是否可影響IECs的分化仍不清楚，本實驗利用Cre/loxp系統(tǒng)建立IECs特異性敲除Depdc5的小鼠模型探究mTORC1過度活化對小腸表型的影響。

在本研究中，IKO組小鼠小腸組織中mTORC1信號通路下游的PS6表達明顯上調，提示IKO組小鼠IECs中mTORC1信號通路明顯活化。此外本研究發(fā)現(xiàn)mTORC1過度活化后小鼠IECs中的杯狀細胞、簇細胞及潘氏細胞明顯減少，隱窩中增殖細胞明顯增多。杯狀細胞合成分泌的黏蛋白是構成腸道黏液的主要成分，完整的腸道黏液屏障使IECs免受腸道內容物及病原生物的損傷[10]。IKO組小鼠小腸組織中Muc2mRNA水平減少，IHC結果顯示杯狀細胞減少，均提示IKO組小鼠腸道黏液屏障功能可能被破壞。有報道指出長期高脂飲食，杯狀細胞和潘氏細胞的細胞數量減少，ISCs數量增加并促進腫瘤干細胞池的擴大，增加癌發(fā)病率[11]。在本研究中Depdc5敲除介導的mTORC1過度激活小鼠小腸隱窩深度增加，隱窩內增殖細胞增多，增多的增殖細胞是否更易誘發(fā)癌變也將在今后進一步探究。上述表型均表明IKO組小鼠IECs穩(wěn)態(tài)被破壞。

為了進一步確認這些表型是因為mTORC1的過度激活所導致，使用mTORC1的抑制劑rapamycin來處理小鼠并分析其表型。發(fā)現(xiàn)rapamycin處理后，能基本挽回(rescue)Depdc5敲除所引起的分泌細胞減少及增殖細胞增多等表型。這與另一研究，敲除mTORC1上游的另一負性調節(jié)因子Tsc2后發(fā)現(xiàn)小鼠IECs中杯狀細胞和潘氏細胞的數量明顯減少較相似[12]，上述研究均表明IECs的分化與mTORC1的過度活化相關。但本研究發(fā)現(xiàn)腸道干細胞分化為簇細胞的數目也減少。

本研究表明Depdc5敲除介導的mTORC1信號通路的過度活化是導致IKO組小鼠腸道表型改變的主要原因。本研究的發(fā)現(xiàn)或許有助于進一步理解腸道疾病的發(fā)病機制，為研究腸道疾病的發(fā)生發(fā)展及治療提供了新的角度。

A.expression of PS6 detected by Western blot；B.mRNA level of Dclk1, Lyz1 and Muc2 detected by qPCR；C.depth of the crypts detected by HE staining (marked by the red line); the number of proliferating cells detected by IHC staining (shown by the red arrow) (×400) (on the bottom)；D.number cluster cells (×200), Paneth cells (×400) deteced by IHC staining and the number of goblet cells (×200) deteced by Alcian blue staining (shown by the red arrow)；*P<0.05 compared with rapamycin control group圖5 雷帕霉素抑制mTORC1調控IECs的分化Fig 5 Rapamycin inhibited mTORC1 to regulate the differentiation of IECs(x±s, n=5)