七氟醚減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠早期腦損傷

張 敏，邢丹丹，康文越，林 慧

(海南省人民醫(yī)院 海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院 麻醉科，海南 海口 570000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)由外傷、高血壓、腦動(dòng)脈畸形及動(dòng)脈瘤等因素誘發(fā)造成，是一種出血性卒中，具有極高的病死率和致殘率[1]。早期腦損傷(early brain injury, EBI)是SAH后高致死、致殘率的主要原因，包括SAH后腦水腫、血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)破壞、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡等病理變化[2-3]。揮發(fā)性麻醉氣體，例如異氟烷和七氟醚(sevoflurane, Sev)，已經(jīng)在各種類型的腦損傷中被發(fā)現(xiàn)具有神經(jīng)保護(hù)作用，如創(chuàng)傷性腦損傷、卒中、腦缺血/再灌注損傷和神經(jīng)退行性疾病，包括SAH[4]。

Sev是最常用的揮發(fā)性麻醉劑之一，在手術(shù)中通過(guò)吸入進(jìn)行誘導(dǎo)和維持麻醉。據(jù)報(bào)道，Sev可通過(guò)降低SAH患者腦脊液caspase-3水平，減緩神經(jīng)元凋亡，減輕SAH后EBI[5]；動(dòng)物研究也證實(shí)在SAH后24 h，給予1.5%的Sev 60 min和3%的Sev 30、60 min，可改善小鼠的神經(jīng)行為功能、腦水腫并減輕神經(jīng)元死亡[6]。這提示，Sev對(duì)SAH后EBI具有顯著的保護(hù)作用；但其發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不完全明確。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。據(jù)報(bào)道，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的失活與SAH誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)[7]；而且激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可顯著改善SAH后的神經(jīng)行為功能并減輕BBB滲漏，保持BBB完整性[8]。Sev對(duì)SAH后EBI的保護(hù)作用是否與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)尚還未可知；因此，本研究擬探討Sev對(duì)SAH大鼠EBI的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6-8周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠90只，體質(zhì)量(280±20)g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證為SCXK(京)2019-0009]。

1.1.2 藥品、試劑：Sev(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司)；Dickkopf-1(DKK1，Wnt/β-catenin通路特異性抑制劑)(北京愛(ài)必信生物技術(shù)有限公司)；伊文思藍(lán)(Evan blue, EB)染色液(南京沃博生物科技有限公司)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP-生物素缺口末端標(biāo)記(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(綠色熒光)、RIPA裂解液、BCA試劑盒(上海碧云天生物科技公司)；兔抗Wnt3a、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、β-catenin、緊密連接蛋白(zonula occludens-1, ZO-1)和claudin-5、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)、occludin、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、β-actin、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、模型組(model組)，Sev低(Sev-L，1.5%)、高劑量組(Sev-H，3%)、Sev+DKK1組(Sev 3%+DKK1 5 μg/kg)[6]，每組18只。按照參考文獻(xiàn)[9]采用血管內(nèi)穿刺法建立SAH大鼠模型，具體操作為：大鼠麻醉后，于頸部正中切一小口，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。將一4-0尼龍縫合線通過(guò)頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，推進(jìn)約3 cm后感覺(jué)到有阻力時(shí)，繼續(xù)將縫合線進(jìn)一步推進(jìn)以刺穿血管?；謴?fù)頸內(nèi)動(dòng)脈血流，血液便可經(jīng)過(guò)穿刺口進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，縫合頸部皮膚切口。Sev+DKK1組大鼠在模型制備前30 min，側(cè)腦室注射5 μg/kg DKK1；Sham組僅插入縫合線，不刺破血管。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：1)有明顯的血管刺破感；2)大鼠有呼吸急促、心率加快的癥狀出現(xiàn)。3)剝離腦組織后可觀察到血液散布在腦底和環(huán)池等部位。造模過(guò)程中死亡和造模失敗大鼠給予補(bǔ)充。

在SAH誘導(dǎo)后1 h，Sev各劑量組和Sev+DKK1組使用小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)面罩吸入Sev(體積分?jǐn)?shù)1.5%、3%)與氧氣的混合氣體，連續(xù)吸入給藥1 h；sham組和model組單純吸入氧氣1 h；麻醉結(jié)束后將大鼠置于籠子中至蘇醒。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分：在SAH后24 h對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，使用改良的Garcia量表。修改后的Garcia量表(最高評(píng)分18分)包括本體觸感、觸須反應(yīng)、自主活動(dòng)、四肢對(duì)稱運(yùn)動(dòng)、攀爬能力和前肢伸展運(yùn)動(dòng)；每個(gè)子測(cè)試的得分從0(最低)到3(最高)。評(píng)分越高代表神經(jīng)功能越好。

1.2.3 伊文思藍(lán)(EB)檢測(cè)血腦屏障通透性：每組隨機(jī)選取6只大鼠，麻醉后，尾靜脈注入2%伊文思藍(lán)(EB)溶液(5 mL/kg)，6 h后行心臟PBS灌注取腦，仔細(xì)分離并去除大腦硬腦膜、小腦以及腦干。精確稱取腦組織，加入2 mL三氯乙酸溶液勻漿，靜置30 min，14 000 r/min離心30 min，取等量上清液(0.8 mL)，用酶標(biāo)儀在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，利用樣品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得EB含量(μg/g腦組織)。EB含量的增大，表示BBB被破壞，通透性增加。

1.2.4 蛛網(wǎng)膜下腔出血評(píng)分(SAH評(píng)分)：每組剩余12只大鼠，通過(guò)SAH分級(jí)系統(tǒng)評(píng)估SAH的嚴(yán)重程度。取出大腦拍照，將大腦底部的照片分為6個(gè)部分，根據(jù)蛛網(wǎng)膜下腔血的量對(duì)其進(jìn)行評(píng)分(0～3分)，計(jì)算總得分(6個(gè)部位分?jǐn)?shù)相加)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：未見(jiàn)出血；1分：極少量凝血塊；2分：中等量蛛網(wǎng)膜下腔出血，但仍可看清血管；3分：大量蛛網(wǎng)膜下腔出血，血管難以辨認(rèn)。

1.2.5 腦含水量(brain water content, BWC)的檢測(cè)：從每組剩余的12只大鼠中隨機(jī)選取6只，去除大腦硬腦膜、小腦以及腦干，0.9%氯化鈉溶液沖洗殘留血跡后，濾紙吸干表面水分，稱重(濕重)。然后，將腦組織在烤箱中干燥72 h，再次稱重(干重)。計(jì)算出BWC的百分比(BWC=[濕重-干重]/濕重)×100%。

1.2.6 TUNEL免疫熒光染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡：每組剩余的6只大鼠，將腦組織冠狀切分為兩部分，一部分液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存，用于Western blot實(shí)驗(yàn)，另一部分在室溫下置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，切片，將切片與蛋白酶K溶液在37 ℃孵育10 min，再用0.3% H2O2處理10 min，與TUNEL反應(yīng)混合物(綠色熒光)在黑暗中于37 ℃孵育60 min。PBS洗滌后與DAPI一起孵育5 min。使用熒光顯微鏡在顳葉皮層5個(gè)隨機(jī)視野中對(duì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過(guò)比較TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目和DAPI陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目確定神經(jīng)元凋亡。

1.2.7 Western blot檢測(cè)腦組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路、BBB及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)：取出-80 ℃冰箱保存的腦組織，剝離顳葉皮層，加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，靜置后離心，提取上清液為總蛋白溶液。用BCA法測(cè)量蛋白濃度后，將樣品與上樣緩沖液混合并在100 ℃下加熱變性5 min，取等量樣品(30 μg/孔)上樣。SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，封閉后將膜與一抗(Wnt3a、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、occludin、ZO-1、claudin-5、MMP-9、Bcl-2、Bax，1∶1 000；β-actin，1∶5 000)4 ℃下孵育過(guò)夜，然后與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)與內(nèi)參的吸光度比值，得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行。將符合正態(tài)分布的測(cè)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。單因素方差分析(one way Anova)用于多組之間的比較，Tukey的事后檢驗(yàn)用于單因素方差分析后的成對(duì)比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分

與sham組相比，model組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.05)；與model組相比，Sev-L、Sev-H組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高(P<0.05)；與Sev-H組相比，Sev+DKK1組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和SAH評(píng)分Table 1 Neurological function score and SAH score of rats in each group (x±s, n=18)

2.2 各組大鼠的SAH評(píng)分

與sham組相比，model組大鼠SAH評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與model組相比，Sev-L、Sev-H組大鼠SAH評(píng)分明顯降低(P<0.05)；與Sev-H組相比，(Sev+DKK1)組大鼠SAH評(píng)分明顯升高(P<0.05)(圖1，表1)。

2.3 各組大鼠腦組織EB滲出量和腦組織含水量(BWC)

與sham組相比，model組大鼠EB滲出量顯著升高(P<0.05)；與model組相比，Sev-L、Sev-H組大鼠EB滲出量明顯降低(P<0.05)，BWC有降低的趨勢(shì)；與Sev-H組相比，Sev+DKK1組大鼠EB滲出量明顯升高(P<0.05)，BWC有所增加(表2)。

A.sham group; B.model group; C.Sev-L group; D.Sev-H group; E.Sev+DKK1 group圖1 各組大鼠全腦蛛網(wǎng)膜下腔出血情況Fig 1 Whole brain subarachnoid hemorrhage of rats in each group(n=12)

表2 各組大鼠EB滲出量和BWCTable 2 EB exudation and BWC of rats in each group(x±s, n=6)

2.4 各組大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡

與sham組相比，model組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯上升，細(xì)胞凋亡率、Bax表達(dá)顯著升高，Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與model組相比，Sev-L、Sev-H組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯下降，細(xì)胞凋亡率、Bax明顯降低，Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與Sev-H組相比，(Sev+DKK1)組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯上升，細(xì)胞凋亡率、Bax明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.05)(圖2～3，表3)。

表3 各組大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及Bcl-2、Bax表達(dá)Table 3 Apoptosis rate and expression of Bcl-2 and Bax in cortical neurons of rats in each group(x±s, n=6)

2.5 各組大鼠腦組織BBB相關(guān)蛋白的表達(dá)

與sham組相比，model組大鼠腦組織occludin、ZO-1、claudin-5表達(dá)顯著降低，MMP-9表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與model組相比，Sev-L、Sev-H組大鼠腦組織occludin、ZO-1、claudin-5表達(dá)明顯升高，MMP-9表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與Sev-H組相比，Sev+DKK1組大鼠occludin、ZO-1、claudin-5表達(dá)明顯降低，MMP-9表達(dá)明顯升高(P<0.05)(圖4，表4)。

表4 各組大鼠腦組織BBB相關(guān)蛋白的表達(dá)Table 4 Expression of BBB related proteins in brain tissue of rats in each group (x±s, n=6)

A.sham group; B.model group; C.Sev-L group; D.Sev-H group; E.Sev+DKK1 group圖2 各組大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡(TUNEL)Fig 2 Cortical neuron apoptosis of rats in each group (TUNEL)(n=12)

A.sham group; B.model group; C.Sev-L group; D.Sev-H group; E.Sev+DKK1 group圖3 各組大鼠腦組織Bcl-2、Bax的表達(dá)Fig 3 Expression of Bcl-2 and Bax in brain tissue of rats in each group(n=12)

A.sham group; B.model group; C.Sev-L group; D.Sev-H group; E.Sev+DKK1 group圖4 各組大鼠腦組織BBB相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig 4 Expression of BBB related protein in brain tissue of rats in each group(n=12)

2.6 各組大鼠腦組織Wnt/GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

與sham組相比，model組大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin表達(dá)顯著降低，p-GSK-3β/GSK-3β比值顯著升高(P<0.05)；與model組相比，Sev-L、Sev-H組大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin表達(dá)明顯升高，p-GSK-3β/GSK-3β表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與Sev-H組相比，Sev+DKK1組大鼠Wnt3a、β-catenin表達(dá)明顯降低，p-GSK-3β/GSK-3β比值明顯升高(P<0.05)(圖5，表5)。

A.sham group; B.model group; C.Sev-L group; D.Sev-H group； E.Sev+DKK1 group圖5 各組大鼠腦組織Wnt/GSK-3β/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig 5 Wnt/GSK-3 in brain tissue of rats in each group β/β-expression of catenin pathway related proteins(n=12)

表5 各組大鼠腦組織Wnt/GSK-3β/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Table 5 Wnt/GSK-3 in brain tissue of rats in each group β/β-expression of catenin pathway related proteins (x±s, n=6)

3 討論

SAH后的EBI是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，腦水腫、BBB破壞、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等是SAH后EBI的關(guān)鍵部分[10]。Sev是一種新型吸入性麻醉劑，具有誘導(dǎo)快、蘇醒快、易于控制、呼吸道刺激小等優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)不同腦部疾病的大腦具有保護(hù)作用，范圍從外傷到缺血或缺氧再灌注損傷[4-5]。而且Sev可抑制SAH后神經(jīng)元凋亡，減輕SAH后的EBI[6]。緊密連接蛋白(ZO-1、occludin和claudin-5)是BBB維持腦微環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵成分。MMP-9降解多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的緊密連接蛋白。本研究結(jié)果顯示，給予1.5%和3%的Sev干預(yù)1 h后，SAH大鼠神經(jīng)功能明顯改善，SAH評(píng)分、EB滲出量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低，且腦組織occludin、ZO-1、claudin-5、Bcl-2表達(dá)升高，MMP-9、Bax表達(dá)降低；提示Sev可改善BBB，抑制神經(jīng)元凋亡，減輕SAH后的EBI。

維持BBB完整性對(duì)于調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，Wnt/β-catenin信號(hào)在BBB的形成和維持中起著至關(guān)重要的作用[8]。Wnt蛋白是一類富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白家族，目前已發(fā)現(xiàn)19種，其中Wnt3a在神經(jīng)系統(tǒng)中有明顯表達(dá)，參與了神經(jīng)分化及發(fā)育過(guò)程。β-catenin是一種細(xì)胞骨架蛋白，是參與調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子。Wnt/β-catenin未被激活時(shí)，β-catenin會(huì)被GSK-3β組成的復(fù)合物磷酸化而降解；β-catenin的失活誘導(dǎo)了成年腦內(nèi)皮細(xì)胞中的BBB分解和特定緊密連接蛋白claudin-5和-3的下調(diào)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，SAH大鼠BBB被破壞的同時(shí)伴隨著腦組織Wnt3a、β-catenin表達(dá)降低，p-GSK-3β/GSK-3β比值升高，說(shuō)明Wnt/GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路被抑制，進(jìn)一步檢測(cè)了腦組織中BBB相關(guān)緊密連接蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，ZO-1、occludin和claudin-5的表達(dá)均降低，再次證實(shí)β-catenin的失活與BBB的破壞有關(guān)。

當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活后，Wnt分泌后能通過(guò)抑制GSK-3β等蛋白組成的β-catenin降解復(fù)合物的降解活性，穩(wěn)定胞質(zhì)中的β-catenin蛋白，進(jìn)入細(xì)胞核后參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。槲皮素可以通過(guò)激活Wnt/β-catenin途徑，減弱MMP-9激活，保護(hù)腦缺血再灌注損傷中的BBB功能障礙，且這些保護(hù)作用可被DKK1逆轉(zhuǎn)[12]。Sev可通過(guò)激活Wnt/GSK-3β/β-catenin通路減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[13]。在SAH后小劑量短期給予Sev可能通過(guò)穩(wěn)定β-catenin來(lái)減輕早期腦水腫[14]；說(shuō)明Sev可抑制β-catenin的降解。在本研究中，給予Sev干預(yù)后，腦組織Wnt3a、β-catenin表達(dá)明顯升高，p-GSK-3β/GSK-3β表達(dá)明顯降低；提示Sev可激活Wnt/β-catenin通路。此外，為了進(jìn)一步驗(yàn)證Sev對(duì)Wnt/β-catenin通路的調(diào)控作用，對(duì)SAH大鼠應(yīng)用了Wnt/β-catenin通路的特異性抑制劑DKK1，結(jié)果顯示，DKK1可明顯削弱Sev對(duì)SAH后EBI的保護(hù)作用，進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論；提示，Sev可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路，減輕SAH后的EBI。

綜上所述，Sev可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路，改善BBB，抑制神經(jīng)元凋亡，減輕SAH后的EBI。本研究?jī)H從動(dòng)物水平進(jìn)行了初步探究，后續(xù)可考慮從體外細(xì)胞水平進(jìn)行深入研究。