莪術(shù)醇抑制人骨肉瘤細(xì)胞系的增殖和促凋亡

江 寧，郭 鈞，劉 鋮，周 舉

(1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心(原中國(guó)人民解放軍第307醫(yī)院)骨科，北京 100007；2.清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院 骨科，北京 100016)

骨肉瘤是骨科惡性腫瘤中最為常見(jiàn)的一種，由間質(zhì)細(xì)胞惡性增生引起，多發(fā)于股骨、脛骨、骨盆等部位，具有高度異質(zhì)性，其特點(diǎn)是形成不成熟的骨樣組織或類(lèi)骨質(zhì)[1]。外科手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療和靶向分子治療是現(xiàn)階段治療骨肉瘤的主要手段[2]，隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)骨肉瘤的不斷探索，越來(lái)越多的分子被證實(shí)參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[3-4]，最新的研究也證實(shí)了，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的異常表達(dá)與骨分化和骨形成有關(guān)，β-catenin在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高，參與調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和凋亡[5]，β-catenin是目前臨床治療骨肉瘤的重要分子靶點(diǎn)。莪術(shù)醇是從傳統(tǒng)中藥姜科植物莪術(shù)中提取出的化合物，具有抗菌、消炎、抗血小板凝集、鎮(zhèn)痛及抗腫瘤活性，對(duì)于胃癌、食管癌、非小細(xì)胞肺癌等實(shí)體瘤均有較好的抑制作用[6-7]，然而目前尚不清楚莪術(shù)醇對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。本次研究旨在探究莪術(shù)醇作用于骨肉瘤細(xì)胞的效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制，希望為骨肉瘤的靶向治療提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63和U2OS(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。

1.1.2 試劑(盒)：莪術(shù)醇溶液(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州泛思生物科技有限公司)；Bax一抗、Bcl2一抗、caspase3一抗和β-catenin一抗[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：將MG-63細(xì)胞、U2OS細(xì)胞置于含10%胎牛血清和0.5%青霉素、0.5%鏈霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，保持培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37 ℃、5% CO2濃度，持續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合達(dá)到80%以上以0.25%胰蛋白酶消化傳代，待細(xì)胞穩(wěn)定增殖后將其分為對(duì)照組、莪術(shù)醇20、40、80和160 μmol/L干預(yù)組，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取經(jīng)上述培養(yǎng)的各組MG-63細(xì)胞和U2OS細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為2×104個(gè)/mL接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組中加入無(wú)血清培養(yǎng)液，莪術(shù)醇0、20、40、80和160 μmol/L給藥組分別加入100 μL以無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度的莪術(shù)醇溶液，待各組溶液滴加完畢，繼續(xù)保持37 ℃、5% CO2濃度培養(yǎng)48 h。48 h后向每孔中避光滴加10 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h后丟棄上層培養(yǎng)液，再滴加100 μL二甲基亞砜溶液，振蕩搖勻后培養(yǎng)10 min，待底部結(jié)晶完全溶解時(shí)，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

1.2.3 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲水平：取對(duì)數(shù)增殖期的上述各組MG-63細(xì)胞和U2OS細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為2×104個(gè)/mL，加入Transwell上室，下室中加600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)12 h后移除上室細(xì)胞，用4%多聚甲醛將下室細(xì)胞固定，結(jié)晶紫染色晾干后拍照并記錄細(xì)胞遷移數(shù)目。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)步驟除Transwell上室需預(yù)先用Matrigel基質(zhì)膠進(jìn)行包被，其他與上述一致。

1.2.4 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取經(jīng)過(guò)不同處理的上述各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞和U2OS細(xì)胞，并將其制成1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，磷酸鹽緩沖液清洗多次后轉(zhuǎn)移至離心管中，高速離心后取細(xì)胞沉淀，加入500 μL按碘化丙啶染色液(×20)∶核糖核酸酶A(×50)=50∶2.5配置的工作液，37 ℃下避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)波長(zhǎng)488 nm處的紅色熒光強(qiáng)度，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白和β-catenin的mRNA表達(dá)：取經(jīng)過(guò)不同處理的上述的各組MG-63細(xì)胞和U2OS細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液沖洗3次后加入Trizol試劑提取骨肉瘤細(xì)胞中的總RNA，調(diào)整RNA濃度后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)部參照，設(shè)置反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 min預(yù)變性，95 ℃ 10 s變性，65 ℃ 30 s退火/延伸，采用PCR儀檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl2、caspase 3和β-catenin的mRNA表達(dá)水平。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design

1.2.6 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白和β-catenin蛋白表達(dá)：取經(jīng)過(guò)不同處理的上述各組人骨肉瘤MG-63細(xì)胞和U2OS細(xì)胞，緩沖液清洗多次后加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，3 000 r/min離心15 min后取上清液保存于-80 ℃條件下，蛋白質(zhì)定量法測(cè)定中蛋白濃度，取20 μg樣品以10% SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離，設(shè)置上層膠電壓為90 V，電泳30 min，設(shè)置分離膠電壓為120 V，電泳2 h，再將蛋白以90 V電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，封閉2 h后加入Bax、Bcl2、caspase 3和β-catenin一抗4 ℃孵育過(guò)夜，Trisl緩沖液漂洗3次后加入二抗室溫下培養(yǎng)2 h，Trisl緩沖液再次漂洗3次后滴加化學(xué)發(fā)光液，以目的蛋白β-actin表示各組蛋白相對(duì)表達(dá)量[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0軟件處理本次所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，Prism8.0軟件繪制圖表，計(jì)數(shù)資料率用(n，%)表示，χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)醇抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖

莪術(shù)醇呈濃度依賴(lài)性地抑制MG-63和U2OS細(xì)胞體外增殖，IC50值分別為128.03 μmol/L、117.95 μmol/L(圖1)。

圖1 莪術(shù)醇對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Effects of curcumol on proliferation of osteosar-coma cells (x±s，n=3)

2.2 莪術(shù)醇抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲

以上述藥物濃度實(shí)驗(yàn)中得出的半數(shù)抑制濃度IC50值128.03 μmol/L、117.95 μmol/L作為后續(xù)莪術(shù)醇組濃度，Transwell檢測(cè)莪術(shù)醇對(duì)骨肉瘤MG-63、U2OS細(xì)胞遷移和侵襲的影響，與對(duì)照組相比，莪術(shù)醇顯著抑制骨肉瘤MG-63、U2OS細(xì)胞的體外遷移和侵襲(P<0.05)(圖2)。

2.3 莪術(shù)醇誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組相比，莪術(shù)醇顯著誘導(dǎo)MG-63、U2OS細(xì)胞凋亡(P<0.05)(圖3)。

2.4 莪術(shù)醇對(duì)Bax、BCl2和caspase 3基因mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，莪術(shù)醇組Bax、caspase 3的mRNA表達(dá)上調(diào)，Bcl2的mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)(圖4)。

2.5 莪術(shù)醇對(duì)Bax、BCl2和caspase 3蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，莪術(shù)醇組Bax、caspase 3的蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl2的蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)(圖5)。

2.6 莪術(shù)醇對(duì)β-catenin基因和蛋白的調(diào)控

與對(duì)照組相比，莪術(shù)醇組MG-63、U2OS細(xì)胞內(nèi)β-catenin的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)均被顯著抑制(P<0.05)(圖6～7)。

3 討論

骨肉瘤具有高度侵襲性，惡性程度高，極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后差[9]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸酶抑制劑等靶向藥物在骨肉瘤的治療中擁有較好的應(yīng)用前景，通過(guò)抑制靶向識(shí)別特定的分子受體，抑制免疫檢查點(diǎn)，發(fā)揮抗腫瘤免疫作用[10]。探究骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，確定有效治療靶點(diǎn)和抗腫瘤藥物，對(duì)于臨床治療而言意義重大。

*P<0.001 compared with control圖2 莪術(shù)醇對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響Fig 2 Effects of curcumol on migration and invasion of osteosarcoma cells(x±s，n=3)

*P<0.001 compared with control圖3 莪術(shù)醇對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響Fig 3 Effects of curcumol on apoptosis of osteosarcoma cells(x±s，n=3)

骨肉瘤的發(fā)病因素較為復(fù)雜，不同于正常細(xì)胞，骨肉瘤等癌細(xì)胞的特點(diǎn)是具有無(wú)限增殖、可發(fā)生上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和易轉(zhuǎn)移能力[11]。本研究結(jié)果表明莪術(shù)醇可顯著抑制骨肉瘤MG-63、U2OS細(xì)胞的遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。莪術(shù)醇等小分子藥物對(duì)于癌的治療效果通常是通過(guò)與癌細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的，在本次研究中，莪術(shù)醇通過(guò)調(diào)控骨肉瘤MG-63和U2OS細(xì)胞內(nèi)的β-catenin的表達(dá)，阻斷Wnt/β-catenin通路的活性，提高莪術(shù)醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。

研究表明， Wnt/β-catenin通路的異常激活與骨肉瘤組織形態(tài)學(xué)的異常、細(xì)胞增殖和分化異常有關(guān)[13]，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin大量積累時(shí)，β-catenin由胞質(zhì)轉(zhuǎn)向胞核，并與細(xì)胞核內(nèi)的T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(T-cell factor/lymphoid enhanc-ing factor，TCF/LEF)等轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，激活下游靶基因的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的異常增殖和凋亡抗性[14]，最終導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。本次研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)醇可顯著抑制細(xì)胞內(nèi)β-catenin的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)。推測(cè)原因可能為莪術(shù)醇可引起骨肉瘤MG-63、U2OS細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致鈣超載[15]，過(guò)量的鈣離子堆積可引起β-catenin上游靶基因糖原合成酶激酶3β表達(dá)增強(qiáng)，而活化的糖原合成酶激酶3β可通過(guò)影響β-catenin的磷酸化和泛素蛋白酶體途徑抑制β-catenin的穩(wěn)定性，從而發(fā)揮抑制骨肉瘤MG-63、U2OS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制骨肉瘤進(jìn)展的作用。

*P<0.001 compared with control圖4 莪術(shù)醇對(duì)骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)Bax、BCl2和caspase 3基因mRNA表達(dá)的影響Fig 4 Effects of curcumol on mRNA expressions of Bax, Bcl2 and caspase 3 genes in osteosarcoma cells(x±s，n=3)

*P<0.001 compared with control圖5 莪術(shù)醇對(duì)骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effects of curcumol on apoptosis-related proteins expressions in osteosarcoma cells(x±s，n=3)

*P<0.05 compared with control圖6 莪術(shù)醇對(duì)骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)β-catenin基因mRNA表達(dá)水平的影響Fig 6 Effects of curcumol on mRNA expression level of β-catenin gene in osteosarcoma cells(x±s，n=3)

綜上所述，莪術(shù)醇通過(guò)抑制β-catenin蛋白的表達(dá)，抑制骨肉瘤MG-63、U2OS細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本次研究結(jié)果提示莪術(shù)醇具有作為骨肉瘤靶向治療藥物的潛力，但也存在一定的局限性，比如僅探討了莪術(shù)醇對(duì)于體外骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)的影響，未驗(yàn)證其是否在活體中擁有相似的效應(yīng)，后續(xù)還需要進(jìn)一步探索。

*P<0.05 compared with control圖7 莪術(shù)醇對(duì)骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)的影響Fig 7 Effects of curcumol on β-catenin protein expression in osteosarcoma cells(x±s，n=3)