5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中分泌型卷曲相關(guān)蛋白1表達(dá)的影響

田平平，寧 潔，鄒 琴，盧雨微，郭 兵，石明雋*

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 三全學(xué)院 擴(kuò)理學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025;3.貴州省常見(jiàn)慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

腎臟纖維化是慢性腎臟疾病發(fā)展的常見(jiàn)病理過(guò)程。各種致病因素刺激使腎臟細(xì)胞不斷分泌炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子等，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的分泌與沉積，最終引起腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改變[3]。

分泌型卷曲相關(guān)蛋白1(secreted frizzled-related protein 1, Sfrp1)屬于分泌型糖蛋白。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)大鼠腎組織中，Sfrp1表達(dá)減少可能參與腎臟纖維化的發(fā)生[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)，Sfrp1甲基化與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，其中DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，Dnmts)扮演著重要角色[5-6]。Dnmts共包含Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3l 5個(gè)成員。在哺乳動(dòng)物中，參與甲基化調(diào)節(jié)的主要有Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b[7]。5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine, 5-Aza-CdR)是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可共價(jià)結(jié)合Dnmts，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

本研究擬從體外水平，利用5-Aza-CdR干預(yù)NRK-52E細(xì)胞，觀(guān)察Sfrp1、Dnmt3a、Dnmt3b、col-Ⅲ及col-Ⅳ在各組細(xì)胞中的表達(dá)變化，探討Dnmt3a、Dnmt3b、col-Ⅲ及col-Ⅳ與Sfrp1的關(guān)系以及Sfrp1在DN腎臟纖維化發(fā)病中的作用及意義，為DN的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物：清潔級(jí)雄性SD大鼠16只，體質(zhì)量(180±20)g[遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCKK(遼)2015-0001]。

1.1.2細(xì)胞：大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞系(NRK-52E細(xì)胞)，購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。

1.1.3試劑及試劑盒：鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)，5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine, 5-Aza-CdR)，小鼠抗大鼠col-Ⅳ單克隆抗體(Sigma-Aldrich公司)；兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋公司)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶(Gibco Introvagen公司)；蛋白提取試劑盒 (北京索萊寶公司)；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(武漢普美克生物技術(shù)有限公司)；兔抗大鼠Dnmt3a、Dnmt3b、Sfrp1和col-Ⅲ多克隆抗體 (北京博奧森公司)；Trizol Regent(Ambion 公司)；Sfrp1和β-actin引物(上海生工生物技術(shù)工程服務(wù)有限公司)；Revert AidTMFirststrand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific公司)；2×SuperReal PreMix Plus(天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 DN模型大鼠復(fù)制：模型復(fù)制方法參照文獻(xiàn)[1-2]。造模前禁食6～8 h，DN組尾靜脈注射STZ 55 mg/kg，NC組尾靜脈注射等量的無(wú)菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后尾靜脈采血檢測(cè)各組大鼠血糖值，以血糖值≥16.7 mmol/L為糖尿病動(dòng)物模型(DM模型)大鼠復(fù)制成功。1周后，對(duì)各組大鼠行尿蛋白定性檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性視為DN模型構(gòu)建成功。10周后乙醚麻醉大鼠，處死前1 d稱(chēng)重，留取24 h尿液；股動(dòng)脈穿刺采血，離心后取血清；0.9% NaCl沖洗腎臟至蒼白色，稱(chēng)重并記錄腎重(mg)/體質(zhì)量(g)比值即腎臟指數(shù)(kidney index, KI)；一側(cè)腎臟固定于4%中性甲醛溶液中行病理學(xué)相關(guān)檢測(cè)；另一側(cè)腎于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生化指標(biāo)的檢測(cè)：氧化酶法測(cè)血清葡萄糖(blood glucose, BG)濃度；鄰苯三酚比色法測(cè)尿蛋白濃度，尿蛋白濃度與24 h尿量乘積為24 h 尿蛋白(24 h urine protein, 24 h UP)；酶分析法檢測(cè)血清肌酐水平。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色：按照免疫組織化學(xué)染色說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：脫蠟、水化、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、抗原修復(fù)、滴加一抗、二抗孵育、DAB顯色、復(fù)染、梯度乙醇脫水。自然晾干后，用二甲苯稀釋后的中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并拍照保存。

1.2.4 細(xì)胞的分組：待NRK-52E細(xì)胞增殖匯合度至90%時(shí)，棄上清，0.25%胰蛋白酶消化，待細(xì)胞變圓加入DMEM培養(yǎng)基，吹打均勻，離心，加培養(yǎng)基重懸。將NRK-52E細(xì)胞隨機(jī)分為正常糖組(NG，葡萄糖5.5 mmol/L)、高糖組(HG，葡萄糖30 mmol/L)和高糖加5-Aza-CdR (80 μmol/L)組(5-Aza-CdR組)，3組細(xì)胞置37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)48 h，提取蛋白和RNA備用。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白：用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度，制備上樣蛋白樣品，SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗孵育，濃度分別為β-actin(1∶4 000)、Dnmt3a(1∶500)、Dnmt3b(1∶500)、Sfrp1(1∶500)、col-Ⅲ(1∶500)及col-Ⅳ(1∶1 000)；4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；1%脫脂牛奶配置的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后，ECL 液顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描檢測(cè)PVDF膜上的目的蛋白曝光度，Image Lab 5.1圖像分析軟件分析蛋白信號(hào)的相對(duì)含量，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各目標(biāo)蛋白的相對(duì)含量。

1.2.6 RT-qPCR檢測(cè)mRNA:Trizol法提取各組NRK-52E細(xì)胞總RNA，按照RevertAidTMFirststrand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄cDNA，按照Talent qPCR PreMix(SYBR Green)說(shuō)明書(shū)行RT-qPCR，引物序列見(jiàn)表1。mRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct方法分析。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Sequence of primers used in RT-qPCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS17.0和GraphPad Prism5統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間比較先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，再采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎臟指數(shù)及相關(guān)生化指標(biāo)

與NC組比較，DN組大鼠KI較高(P<0.05)；DN組大鼠BG、24 hUP、肌酐水平較NC組升高(P<0.05)(圖1)。提示DN模型大鼠復(fù)制成功。

*P<0.05 compared with NC group圖1 兩組大鼠KI、BG、24 h UP、肌酐水平比較Fig 1 Comparison of kidney index, blood glucose, 24 h urinary protein and creatinine levels between the two groups of rats(x±s,n=8)

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

可清晰檢測(cè)出Sfrp1蛋白在腎臟組織中的表達(dá)位置和表達(dá)量?？梢?jiàn)Sfrp1蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈棕紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。結(jié)果顯示，NC組Sfrp1陽(yáng)性表達(dá)主要分布于腎小管上皮細(xì)胞，而DN組大鼠Sfrp1表達(dá)不明顯(圖2)。

圖2 兩組大鼠腎臟組織中Sfrp1的表達(dá)Fig 2 Expression of Sfrp1 in kidney tissues between the two groups of rats

2.3 5-Aza-CdR干預(yù)高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞后，Sfrp1表達(dá)恢復(fù)

與NC組比，HG組Sfrp1蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，而給予5-Aza-CdR干預(yù)后，Sfrp1蛋白表達(dá)較HG組增多(P<0.05)(圖3)。RT-qPCR結(jié)果與蛋白表達(dá)水平結(jié)果趨向一致(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with HG group圖3 各組細(xì)胞中Sfrp1蛋白表達(dá)量的比較Fig 3 Comparison of Sfrp1 protein expression in each group(x±s,n=3)

*P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with HG group圖4 各組細(xì)胞中Sfrp1 mRNA 表達(dá)量的比較Fig 4 Comparison of Sfrp1 mRNA expression in each group(x±s,n=3)

2.4 5-Aza-CdR干預(yù)高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞后，Dnmt3a和Dnmt3b蛋白表達(dá)減少

與NC組比，HG組Dnmt3a和Dnmt3b蛋白表達(dá)增多(P<0.05)，而與HG組比，5-Aza-CdR組Dnmt3a和Dnmt3b蛋白表達(dá)減少(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with HG group圖5 各組細(xì)胞中Dnmt3a、Dnmt3b蛋白表達(dá)量的比較Fig 5 Comparison of Dnmt3a, Dnmt3b protein expression in each group(x±s,n=3)

2.5 5-Aza-CdR干預(yù)高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞后，col-Ⅲ和col-Ⅳ蛋白表達(dá)減少

與NC組比，HG組col-Ⅲ和col-Ⅳ蛋白表達(dá)增多(P<0.05)；而與HG組比，5-Aza-CdR組col-Ⅲ和col-Ⅳ蛋白表達(dá)減少(P<0.05)(圖6)。

*P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with HG group圖6 各組細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的比較Fig 6 Comparison of related proteins expression in each group(x±s,n=3)

2.6 Sfrp1與Dnmt3a、Dnmt3b、col-Ⅲ及col-Ⅳ蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)

腎小管上皮細(xì)胞中Sfrp1與Dnmt3a(r=-0.937，P<0.05)、Dnmt3b(r=-0.965，P<0.05)、col-Ⅲ(r=-0.694，P<0.05)及col-Ⅳ(r=-0.888，P<0.05)均呈負(fù)相關(guān)(圖7)。

3 討論

隨著全球人口老齡化的加速，DM已成為影響人類(lèi)健康的重大問(wèn)題。DN是DM的主要微血管并發(fā)癥。研究表明，表觀(guān)遺傳機(jī)制所介導(dǎo)的基因調(diào)控與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。表觀(guān)遺傳學(xué)涉及DNA甲基化、組蛋白修飾、微小RNA、染色質(zhì)重塑等[10]。近年來(lái)DNA甲基化受到研究者的廣泛關(guān)注。

Dnmts是DNA甲基化過(guò)程中的關(guān)鍵酶，通過(guò)其催化作用參與DNA甲基化修飾[11-12]。在哺乳動(dòng)物中，Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b具有催化活性，其異常表達(dá)可影響DNA甲基化水平和后期轉(zhuǎn)錄合成[4]。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[7]，在糖尿病腎臟疾病大鼠腎組織中， Dnmt1、 Dnmt3a、 Dnmt3b、 Dnmt3l表達(dá)增高。其中，Dnmt3a和Dnmt3b與Sfrp1的相關(guān)性更明顯。本次體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Dnmt3a、Dnmt3b與Sfrp1呈負(fù)相關(guān)，與前期結(jié)果一致。

A.correlation between Sfrp1 and Dnmt3a; B.correlation between Sfrp1 and Dnmt3b; C.correlation between Sfrp1 and col-Ⅲ; D.correlation between Sfrp1 and col-Ⅳ圖7 Sfrp1與Dnmt3a、Dnmt3b、col-Ⅲ、col-Ⅳ蛋白表達(dá)相關(guān)Fig 7 Correlation between Sfrp1 and protein expression of Dnmt3a, Dnmt3b, col-Ⅲ and col-Ⅳ

研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，Sfrp1在直腸癌、腎癌等腫瘤疾病中處于高甲基化水平，低表達(dá)狀態(tài)。本次實(shí)驗(yàn)以NRK-52E細(xì)胞為研究對(duì)象，將細(xì)胞分為NC、HG和5-Aza-CdR組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR組Dnmt3a和Dnmt3b表達(dá)較HG組降低，且在一定程度上恢復(fù)了Sfrp1的表達(dá)。同時(shí)5-Aza-CdR組NRK-52E細(xì)胞纖維化程度降低到接近正常細(xì)胞水平，提示Dnmt3a和Dnmt3b可能與Sfrp1甲基化有關(guān)，并影響腎臟纖維化的發(fā)生。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示col-Ⅲ、col-Ⅳ與Sfrp1呈負(fù)相關(guān)。提示，Sfrp1表達(dá)降低可能導(dǎo)致腎臟纖維化時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多。

綜上所述，5-Aza-CdR可能通過(guò)抑制Dnmt3a、Dnmt3b的表達(dá)，改善腎臟纖維化，其機(jī)制可能與抑制Sfrp1甲基化，恢復(fù)Sfrp1表達(dá)有關(guān)，但Dnmt3a、Dnmt3b與Sfrp1的具體作用位點(diǎn)仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。