老年血液透析患者血清miR-21與T細(xì)胞相關(guān)

王 珊，楊華昱，孫 穎，馬 清

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科， 北京 100050)

隨著老齡化社會(huì)的到來，進(jìn)展到尿毒癥的老年慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者逐步增多。血液透析是治療尿毒癥的有效手段，近來有研究表明，維持性血液透析(maintenance hemodialy-sis，MHD)可以清除尿毒癥患者體內(nèi)大部分毒素，但血液透析本身卻刺激氧化應(yīng)激和誘發(fā)微炎性反應(yīng)(microinflammation)狀態(tài)[1]，最終增加心血管疾病、感染的患病率和癌癥風(fēng)險(xiǎn)[2]。在研究中發(fā)現(xiàn)，MHD患者較健康人群存在明顯的免疫功能障礙，出現(xiàn)單核細(xì)胞的促炎表型[3]、CD4+/CD8+細(xì)胞比例倒置等情況，從而增加發(fā)生膿毒癥的概率[4-5]。MicroRNAs(miRNAs)是一種小的非編碼RNA，主要通過結(jié)合至靶mRNA從而抑制蛋白翻譯或促進(jìn)mRNA降解來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)[6]。研究發(fā)現(xiàn)血清miRNAs是免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控免疫細(xì)胞中相關(guān)基因的變化，從而調(diào)控體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的變化[7]。老年MHD患者出現(xiàn)致命性感染性疾病的可能性更大，但關(guān)于老年MDH患者微炎性反應(yīng)、體內(nèi)免疫功能情況和miRNAs之間相關(guān)性的研究較少，為進(jìn)一步探討老年MDH患者的免疫功能和miRNAs譜的變化，本研究除常規(guī)檢測(cè)患者的外周血T淋巴細(xì)胞亞群情況、炎性指標(biāo)與miRNAs的變化情況，還分析了老年MDH患者透析前后CD4+和Treg細(xì)胞百分率、miR-21相對(duì)表達(dá)量之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象：本研究中的觀察組為2020年1月至2021年1月在北京友誼醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科血液透析室就診的28例老年MDH患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)年齡≥65歲；2)于北京友誼醫(yī)院進(jìn)行規(guī)律血液透析時(shí)間長(zhǎng)于1年。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)存在急性感染、外科創(chuàng)傷等急性疾??；2)存在肝功能衰竭、惡性腫瘤晚期、血液病等疾病。以上患者的平均透析時(shí)間為(4.3±2.6)年。在“透析前后血清miR-21表達(dá)水平與CD4+、Treg 及Treg/CD4+的相關(guān)性分析”研究部分，收集了觀察組中21例患者透析前后的血液樣本，另7例患者未采集透析后血液樣本。

同時(shí)，選取2020年1月至2021年1月在北京友誼醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科體檢進(jìn)行健康體檢的65歲以上老年人群作為對(duì)照組，共有47例。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)存在3期及以上分期的CKD；2)曾進(jìn)行腎切除，或患有腎小球腎炎、IgA腎病等腎臟疾??；3)存在急性感染、外科創(chuàng)傷等急性疾??；4)存在肝功能衰竭、惡性腫瘤晚期、血液病等疾病。本文研究通過北京市友誼醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批文號(hào)：2022-P2-120-01)，本研究程序均符合醫(yī)院倫理委員會(huì)制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 試劑：Trizol試劑、miRNAs及對(duì)照引物序列(Invitrogen公司)，引物序列見表1；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒(Transgene公司)；SYBR預(yù)混試劑(TaKaRa公司)； miRcute Plus miRNA定量PCR檢測(cè)試劑盒(天根生化科技有限公司SYBR?Green)；人淋巴細(xì)胞分離液(達(dá)科為公司優(yōu)達(dá)?)；CD3、CD4、CD8、CD56、CD16、CD25、CD127 (IL-7Rα)抗體(Biolegend公司)；流式細(xì)胞儀(賽默飛公司Attune?NxT流式細(xì)胞儀)。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification

1.2 方法

1.2.1 治療方法：入組的MHD患者均應(yīng)用德國(guó)費(fèi)森血液透析機(jī)(型號(hào)4008S)進(jìn)行常規(guī)血液透析治療，頻率為每次4 h，每周3次。血液透析過程所用濾器為FX80高通量透析器(型號(hào)4008S)，透析膜表面積為1.8 m2，超濾系數(shù)40 mL/(h×mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)，血流速在200～250 mL/min，透析液流量500～700 mL/min。

1.2.2 標(biāo)本采集和指標(biāo)檢測(cè)：本研究中MHD組患者在血液透析治療前和治療結(jié)束時(shí)采集血樣，對(duì)照組均在入組后當(dāng)天或次日空腹時(shí)采集血樣。 之后在本院化驗(yàn)室測(cè)定血常規(guī)、血糖、肝腎功能、C反應(yīng)蛋白(CRP，C-reactionprotein)、白介素-6(IL-6，interleukin-6)等實(shí)驗(yàn)室資料[8]。

1.2.3 外周血T淋巴細(xì)胞檢測(cè)：MHD組和對(duì)照組采樣時(shí)間同前，采集外周血3～4 mL，加入等體積淋巴細(xì)胞分離液、1×PBS，離心30 min后吸取白膜層，用1×PBS重復(fù)洗滌2次后制成1×107個(gè)/mL單個(gè)核細(xì)胞的混懸液，每個(gè)樣本各取100 μL分別放入兩個(gè)試管，加入5 μL Human TruStain FcX抗體孵育10 min，之后分別加入相應(yīng)表面抗體各2 μL[即CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、CD16+抗體，或CD3+、CD4+、CD25+、CD127(IL-7Rα)抗體]混勻后避光孵育20 min，離心洗滌細(xì)胞后加入500 μL 2%多聚甲醛重懸染色細(xì)胞并室溫靜置20 min后上機(jī)檢測(cè)。之后利用Attune? NxT流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+、CD3-CD56+CD16+自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)、CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg細(xì)胞)，所有操作步驟嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR：抽取兩組人群外周血5 mL，分離血清，先用Trizol試劑提取總RNA，然后利用cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用SYBR預(yù)混試劑及ABI7500定量PCR儀進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，以人snRNA U6 (human snRNA U6)為內(nèi)參，PCR引物序列見表1。采用2-△△Ct的方法對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示計(jì)量資料數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較；計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，利用Pearson相關(guān)分析比較兩種參數(shù)之間的相關(guān)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

分析觀察組和對(duì)照組的基線資料，可看出兩組人群在年齡上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，血液透析患者的收縮壓較對(duì)照組明顯增高，血紅蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白水平均偏低(P<0.001)，而估算腎小球?yàn)V過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)明顯偏低，尿素氮水平明顯增高(P<0.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 觀察組和對(duì)照組的基本情況Table 2 Characteristics between observation group and the control group(x±s)

2.2 老年MHD患者外周血淋巴細(xì)胞亞群比例、炎性指標(biāo)和miRNAs相對(duì)表達(dá)量

老年MHD患者透析前的CD4+淋巴細(xì)胞和Treg細(xì)胞的百分比較對(duì)照組明顯增高(P<0.001)， 中性粒細(xì)胞百分比、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、C反應(yīng)蛋白(C-reactionprotein，CRP)等炎性指標(biāo)也較對(duì)照組明顯增高(P<0.001)。同時(shí)，老年MHD患者透析前miR-21-5p的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組有所增高(P<0.05)(表3)。

表3 觀察組和對(duì)照組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例以及炎性指標(biāo)、miRNAs表達(dá)量比較Table 3 Percentage of T lymphocyte subsets, and expres-sion of inflammatory indicators and miRNAs in peripheral blood between observation group and control group

2.3 老年MHD患者透析前后miR-21相對(duì)表達(dá)量、Treg細(xì)胞和CD4+淋巴細(xì)胞比率的變化

收集觀察組中21例患者透析前后的血液樣本，發(fā)現(xiàn)血液透析后eGFR、尿素氮、血磷、血鉀水平明顯下降(P<0.001)，血鈣水平有所增高(P<0.001)。尿素下降率(urea reduction ratio，URR)的中位數(shù)為72.3(68.1，74.2)，尿素清除指數(shù)(Kt/V)的中位數(shù)為1.32(1.25，1.41)，透析充分性良好。透析后miR-21相對(duì)表達(dá)量和Treg細(xì)胞的比率均有所增高(P<0.05)(表4)。

表4 血液透析前及血液透析后MHD患者一般情況變化Table 4 Characteristics of the MHD patients before and after dialysis

2.4 老年MHD患者透析前后血清miR-21表達(dá)水平與CD4+、Treg 及Treg/CD4+的相關(guān)性分析

利用Pearson相關(guān)分析老年MHD患者透析前和透析后血清miR-21相關(guān)表達(dá)量，分別與外周血CD4+、Treg細(xì)胞比率之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)血清miR-21相關(guān)表達(dá)量在透析后與CD4+淋巴細(xì)胞比率呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.867，P=0.039)。而透析前后血清miR-21相關(guān)表達(dá)量均與Treg細(xì)胞比率呈正相關(guān)(血液透析前r=0.5，P=0.021，血液透析后r=0.532，P=0.015)(P<0.05)，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且透析后兩者相關(guān)性更加顯著(表5)。

表5 血液透析前后miR-21相對(duì)表達(dá)量以及CD4+、Treg細(xì)胞比率比較Table 5 Expression of miR-21 and percentage of CD4+ and Treg cell in peripheral blood before and after dialysis

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告顯示中國(guó)CKD患病率高達(dá)10.8%[9]，而老年人CKD的患病率可高達(dá)23.4%～35.8%[10]。老年CKD患者進(jìn)展至終末期腎病的發(fā)病率也逐漸增高，目前已成為一項(xiàng)嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問題。血液透析可有效清除體內(nèi)毒素和調(diào)節(jié)電解質(zhì)紊亂。隨著血液透析方式的不斷更新，MHD患者長(zhǎng)期存活率明顯增加，也加大了老年MHD患者數(shù)量和比例，但隨之而來的微炎性反應(yīng)狀態(tài)誘發(fā)的致命性感染疾病比例逐步增多，嚴(yán)重影響預(yù)后。因此，如何評(píng)估老年MHD患者的炎性反應(yīng)狀態(tài)和免疫功能情況顯得尤為重要。

既往多項(xiàng)研究顯示終末期腎病患者存在免疫功能紊亂，認(rèn)為與尿毒癥血清中較高水平的促炎細(xì)胞因子有關(guān)，當(dāng)血液在透析膜中流動(dòng)時(shí)會(huì)引起以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞募集為特征的異物反應(yīng)，從而釋放促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致機(jī)體長(zhǎng)期處于微炎性反應(yīng)狀態(tài)，主要體現(xiàn)在IL-6、TNF-α及CRP水平明顯增高[11]。本研究結(jié)果顯示老年MHD患者的中性粒細(xì)胞百分比、IL-6、CRP明顯增高，且存在血紅蛋白、白蛋白水平下降，均提示存在微炎性反應(yīng)狀態(tài)，有營(yíng)養(yǎng)不良風(fēng)險(xiǎn)。Treg細(xì)胞是免疫穩(wěn)態(tài)的重要貢獻(xiàn)者，其調(diào)節(jié)失調(diào)可導(dǎo)致免疫耐受喪失和自身免疫性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)入組的老年MHD患者透析前CD4+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的百分比率較對(duì)照組明顯增高，說明老年MHD患者體內(nèi)存在微炎性反應(yīng)狀態(tài)，從而刺激CD4+細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成。對(duì)老年MHD患者的透析前后血樣進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，入組的老年MHD患者透析充分性良好，Treg細(xì)胞比率有所增加，說明經(jīng)血液透析后患者免疫功能略有恢復(fù)。

有研究發(fā)現(xiàn)血液透析后血清中miR-499、miR-21-5p、miR-210等相對(duì)表達(dá)量上調(diào)[12]。本研究揭示老年MHD患者透析前miR-21-5p相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組增高，且透析后miR-21-5p的相對(duì)表達(dá)量有所上調(diào)，這與既往研究相同。既往多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p表達(dá)上調(diào)促使白細(xì)胞數(shù)量增加，同時(shí)引起TNF-α、IL-6等炎性因子的釋放[13]。本研究發(fā)現(xiàn)透析前后miR-21表達(dá)量與Treg細(xì)胞比率呈正相關(guān)，推測(cè)miR-21-5p表達(dá)上調(diào)可引起Treg細(xì)胞的增多，進(jìn)一步支持miRNAs參與血液透析過程中免疫功能的調(diào)節(jié)，這可能為利用miRNAs評(píng)估老年MHD微炎性反應(yīng)狀態(tài)和免疫功能情況提供新的方向。