miR-486參與OSAHS合并繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥的發(fā)生

石雪峰，孫澤蕊，3，何 響，3，解友邦，顧玉海，多 杰*

(青海省人民醫(yī)院 1.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科; 2.血液風(fēng)濕科，青海 西寧 810007; 3.青海大學(xué)，青海 西寧 810000)

阻塞性睡眠呼吸暫停/低通氣綜合征(obstruc-tive sleep apnea/hypoventilation syndrome, OSAHS)是一種常見的疾病，影響大約10%～17%的成年人[1]。OSAHS的特征是睡眠期間反復(fù)呼吸暫停導(dǎo)致間歇性低氧(intermittent hypoxia, IH)、喚醒、夜間低氧血癥和胸腔內(nèi)壓力變化，反復(fù)的間歇性低氧導(dǎo)致紅細(xì)胞繼發(fā)性增多，從而導(dǎo)致繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥(secondary polycythemia，SP)的發(fā)生。

miR-486最早是由人胎肝組織中鑒定的microRNA(miRNA)，除被證明為是一種低氧相關(guān)的miRNA[2]， 亦被證實(shí)與造血細(xì)胞的糖代謝有關(guān)[3]。研究顯示沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)可能參與了OSAHS的發(fā)病過程[4-5]，作者既往研究顯示miR-486可以通過調(diào)控Sirt1調(diào)控造血細(xì)胞TF-1細(xì)胞紅系分化過程[6]。加之，繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥被普遍認(rèn)為是OSAHS的主要并發(fā)癥之一，與OSAHS的發(fā)展之間存在密切關(guān)聯(lián)[7]。因此，本研究旨在探討miR-486是否參與了OSAHS相關(guān)SP病理過程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及病例:紅白血病細(xì)胞K562細(xì)胞由青海省人民醫(yī)院血液研究室保存。選取2020年5月至2021年4月在青海省人民醫(yī)院門診及健康體檢中心就診的漢族健康體檢者25名作為對照組，于該院就診的OSAHS合并繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥的30例患者作為(OSAHS+SP)組。納入(OSAHS+SP)組患者符合2017美國睡眠學(xué)會《成人阻塞性睡眠呼吸暫停診斷臨床指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。且符合紅細(xì)胞增多癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。所有受試者均簽署患者知情同意書后入組，且排除其他呼吸系統(tǒng)疾病，真性紅細(xì)胞增多癥等疾病。一般情況見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequence of all primer

1.1.2 試劑(盒)：RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司)， 胎牛血清(Applied Stem Cell公司)， 兔抗人Sirt1抗體(Abcam公司)， 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG 二抗(北京中衫金橋公司)， Trizol(Invitrogen 公司)，miR-486引物、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR檢測試劑盒(ABI公司)， RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco 公司)， 胎牛血清(Applied Stem Cell公司)，Sirt1ELISA 試劑盒(上海西唐實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：將K562分為：1)間歇性低氧： 一個間歇性低氧循環(huán)為2% O284 s，19% O25 min，共進(jìn)行60個循環(huán)。2)miR-486沉默或過表達(dá)K562細(xì)胞及Sirt1沉默細(xì)胞，均采用慢病毒技術(shù)進(jìn)行沉默或過表達(dá)。

1.2.2 血漿收集及外周血單個核細(xì)胞提?。喝∏宄靠崭轨o脈血5 mL，3 500 r/min 離心15 min 后收集血漿于-80 ℃儲存。取清晨空腹靜脈血5 mL，用等體積的PBS稀釋并混勻，貼壁加入盛有外周血淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心后取上層與中層之間的單個核細(xì)胞層至新的離心管，PBS洗2～3次后-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-qPCR檢測miR-486、Sirt1、GATA-1及GATA-2的表達(dá)：分別用Trizol裂解單個核細(xì)胞、IH及慢病毒處理的K562細(xì)胞，按步驟加入三氯甲烷及異丙醇提RNA。以β-actin為內(nèi)參，用SYBR法檢測miR-486、Sirt1、 GATA-1及 GATA-2的表達(dá)。以U6為內(nèi)參,用Taqman microRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書及特定引物進(jìn)行miRNA的反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR測定，循環(huán)數(shù)為40個，以 2-ΔΔCt計(jì)算相對表達(dá)量。

1.2.4 ELISA檢測血漿Sirt1濃度:實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。

1.2.5 Western blot 檢測Sirt1表達(dá):K562細(xì)胞經(jīng)慢病毒過表達(dá)或沉默miR-486后提取蛋白，進(jìn)行蛋白定量后以20 μg上樣，進(jìn)行跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉及加稀釋一抗(Sirt1/GAPDH)4 ℃慢搖過夜，次日洗膜3次后加二抗室溫慢搖1 h，再次洗膜3次后加發(fā)光液檢測蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示;采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并分析，兩組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson。

2 結(jié)果

2.1 入組病例一般資料對比

OSAHS合并SP患者體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)、睡眠呼吸暫停指數(shù)(apnea hypopnea index，AHI)、紅細(xì)胞及血紅蛋白相對于對照組明顯升高(P<0.001)(表2)。

表2 對照組及OSAHS+SP患者一般資料對比Table 2 Characteristics of control group and the OSAHS combined with secondary polycythemia group

2.2 對照組及OSAHS+SP單個核細(xì)胞miR-486、Sirt1、GATA-1 mRNA表達(dá)水平及血漿Sirt1濃度

與對照組相比，OSAHS+SP患者血漿miR-486表達(dá)升高，Sirt1表達(dá)mRNA水平及蛋白水平均降低，GATA-1表達(dá)亦降低(P<0.001)。然而，在兩組外周血單個核細(xì)胞中均未檢測到GATA-2表達(dá)(表3)。

表3 外周血單個核細(xì)胞miR-486、Sirt1、GATA-1及血漿Sirt1濃度Table 3 Expression of miR-486, Sirt1, GATA-1 in PBMC and plasma Sirt1 concentraion

2.3 OSAHS+SP患者相關(guān)性分析

OSAHS+SP患者單個核細(xì)胞miR-486、Sirt1、GATA-1 mRNA表達(dá)水平及血漿Sirt1濃度與AHI、HB均具有相關(guān)性。其中單個核miR-486、GATA-1均與AHI及HB呈正相關(guān)(P<0.05)。而單個核細(xì)胞Sirt1mRNA表達(dá)、血漿Sirt1表達(dá)水平與AHI及HB均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(表4)。

表4 外周血單個核細(xì)胞miR-486、Sirt1、GATA-1及血漿Sirt1表達(dá)與AHI和Hb的相關(guān)性Table 4 Correlation of PBMC miR-486, Sirt1, GATA-1 expression and plasma concentration with AHI and Hb

2.4 miR-486通過下調(diào)Sirt1調(diào)控OSHAS相關(guān)繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥的發(fā)生

IH可以促進(jìn)K562細(xì)胞miR-486的表達(dá)(左)，而抑制Sirt1表達(dá)(右)。K562細(xì)胞過表達(dá)miR-486可以同時從RNA及蛋白水平抑制Sirt1的表達(dá)，而沉默miR-486后Sirt1在RNA水平及蛋白水平均表達(dá)升高。沉默Sirt1后GATA-1的表達(dá)升高(圖1)。

3 討論

間歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)是OSAHS的基本特征，主要由于呼吸道阻塞所致，表現(xiàn)為睡眠障礙和間斷缺氧。OSAHS患者除白天嗜睡外,嚴(yán)重者還可表現(xiàn)為紅細(xì)胞增多、血小板活化及血栓性疾病。

A.expression of miR-486 and Sirt1 in K562 cells after IH treatment； B.Sirt1 expression after miR-486 over-expression or inhibition-RT-qPCR； C.expression of GATA-1 after Sirt1 inhibition； D.Sirt1 expression after miR-486 over-expression or inhibition-Western blot; *P<0.05 compared with control圖1 miR-486通過下調(diào)Sirt1調(diào)控GATA-1表達(dá)Fig 1 miR-486 down-regulated Sirt1 expression and up-regulated GATA-1 expression

GATA-1是GATA家族的創(chuàng)始成員，可正向調(diào)控紅系細(xì)胞發(fā)育，GATA-2主要維持和促進(jìn)早期造血組細(xì)胞的分化過程。研究亦顯示先天性GATA-1突變與先天性紅系發(fā)育不全相關(guān)[10]。GATA-1可激活血紅素合成，GATA1和血紅素一起介導(dǎo)紅細(xì)胞的成熟[11]。因此， GATA-1與造血細(xì)胞紅系分化密切相關(guān)。本研究顯示OSAHS合并繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥患者外周血單個核細(xì)胞GATA-1表達(dá)明顯升高，而未檢測到GATA-2的表達(dá)，提示GATA-2在外周血單個核細(xì)胞中不存在表達(dá)或表達(dá)量極低。因此，研究推測GATA-1可能同樣參與了OSAHS相關(guān)繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥的發(fā)病過程。

表觀遺傳調(diào)控在OSAHS的各種不良反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[12]。miR-486是首先于胎肝中發(fā)現(xiàn)的miRNA，參與了造血紅系分化過程。研究表明miR-486參與了紅細(xì)胞生成調(diào)控過程[13]。作者既往研究亦顯示在TF-1細(xì)胞中miR-486可能通過調(diào)控其靶基因Sirt1調(diào)控造血細(xì)胞紅系分化[3]。本研究顯示OSAHS合并SP患者外周血單個核細(xì)胞miR-486的表達(dá)是升高的，而單個核細(xì)胞Sirt1表達(dá)及血漿Sirt1濃度均是降低的。相關(guān)性分析顯示OSAHS合并SP患者單個核細(xì)胞miR-486、Sirt1、GATA-1、血漿Sirt1均與患者AHI及HB具有顯著相關(guān)性。因此，本研究推測miR-486可能通過調(diào)控Sirt1表達(dá)調(diào)控GATA-1的表達(dá)參與了OSAHS相關(guān)繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥的發(fā)病過程。并且，外周血單個核細(xì)胞miR-486、Sirt1及GATA-1表達(dá)水平及血漿Sirt1濃度可能是OSAHS合并繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥疾病嚴(yán)重程度的輔助評估指標(biāo)。

間歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)是OSAHS的基本特征，為進(jìn)一步明確miR-486在OSAHS合并繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥發(fā)病中的調(diào)控機(jī)制，將K562細(xì)胞進(jìn)行IH處理后檢測miR-486等的表達(dá)，結(jié)果顯示IH可以促進(jìn)K562細(xì)胞miR-486的表達(dá)，抑制Sirt1的表達(dá)。應(yīng)用慢病毒技術(shù)將K562細(xì)胞過表達(dá)miR-486后Sirt1表達(dá)降低，而沉默miR-486后Sirt1表達(dá)升高，進(jìn)一步明確了Sirt1為miR-486的靶基因。同時，研究結(jié)果顯示沉默Sirt1后GATA-1表達(dá)升高。提示IH可能通過上調(diào)miR-486的表達(dá)從而下調(diào)Sirt1的表達(dá)參與OSAHS相關(guān)SP的發(fā)生。

應(yīng)用TransmiR v2.0數(shù)據(jù)庫對轉(zhuǎn)錄因子GATA-1調(diào)控的miRNA進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示GATA-1可能通過多個結(jié)合位點(diǎn)作用于miR-486, 在血液中起到調(diào)控miR-486表達(dá)的作用。因此本研究推測miR-486通過靶向Sirt1上調(diào)GATA-1的表達(dá)，而作為轉(zhuǎn)錄因子的GATA-1可以通過多位點(diǎn)與miR-486結(jié)合上調(diào)miR-486表達(dá)，從而導(dǎo)致疾病的惡性循環(huán)過程。

因此，本研究認(rèn)為miR-486、Sirt1及GATA-1可能參與了OSAHS相關(guān)SP的病理過程，其中miR-486和GATA-1起正調(diào)控作用，Sirt1起負(fù)調(diào)控作用。并且研究顯示間歇性低氧通過上調(diào)miR-486的表達(dá)，下調(diào)Sirt1的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)GATA-1的表達(dá)參與了OSAHS相關(guān)SP的發(fā)生。