PTOV1表達(dá)水平對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響

謝思安，陳奕陽，徐俊玄，寧婷婷，張 楠，朱圣韜，張澍田*

(首都醫(yī)科大學(xué)北京友誼醫(yī)院 1.消化內(nèi)科； 2.檢驗(yàn)科，北京 100050)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，也是全球因腫瘤死亡的主要原因之一[1]。根據(jù)2020年全球癌統(tǒng)計(jì)，CRC已成為全球第三大最常見腫瘤，也是癌相關(guān)死亡的第二大原因。盡管CRC診斷方法和治療戰(zhàn)略不斷改進(jìn)，但2020年仍造成全球約93萬人死亡[2]。鑒于CRC早期臨床癥狀不明顯，因此尋找新的敏感的CRC診斷生物標(biāo)志物有助于早期診斷和評(píng)估疾病預(yù)后。

前列腺腫瘤過表達(dá)1(prostate tumor over-expressed 1，PTOV1)是2001年在前列腺癌組織過表達(dá)基因差異篩查項(xiàng)目中首次發(fā)現(xiàn)的新基因。因其在正常前列腺組織中基本未檢出或表達(dá)極低，而在前列腺癌組織中高度表達(dá)，故命名為PTOV1[3]。在前列腺癌中，PTOV1表達(dá)水平與細(xì)胞增殖指數(shù)呈正相關(guān)，是影響前列腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵因素。同時(shí)，在侵襲性較強(qiáng)的腫瘤中，PTOV1的表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)及預(yù)后相關(guān)，提示該蛋白可能是腫瘤侵襲性疾病的一種新的標(biāo)志物[4]。然而，PTOV1在CRC中的差異表達(dá)及臨床意義尚不清楚。

本研究基于生物信息學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中，PTOV1的表達(dá)異常升高且與CRC患者不良預(yù)后相關(guān)，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討PTOV1表達(dá)水平對(duì)CRC細(xì)胞增殖能力的影響，為CRC的早期診斷和治療提供新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料： DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清及0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；蛋白分子質(zhì)量標(biāo)志物、BCA蛋白定量試劑盒及Trizol(Thermo Fisher Scientific 公司)；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、OPTI-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen 公司)；青鏈霉素混合液(華中海威公司)；siRNA(蘇州吉瑪生物科技有限公司)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega 公司); 2×SYBR Mix(康潤誠業(yè)公司)；引物(上海生工生物工程股份有限公司)；RIPA裂解液(北京碧云天公司)；EdU檢測(cè)試劑盒(CellLight 公司)；抗GAPDH抗體、抗PTOV1抗體(Proteintech公司)。

1.1.2 細(xì)胞系： 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460、結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、HT29、SW480、HCT15和RKO(中國科學(xué)院細(xì)胞型庫及上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)。

1.2 方法

1.2.1PTOV1在CRC組織及細(xì)胞系中的表達(dá)分析： 由UCSC Xena數(shù)據(jù)庫中獲得包括mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)和患者臨床信息的TCGA-COADREAD數(shù)據(jù)集，包含638例CRC組織和51例癌旁組織中的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，用以分析PTOV1在結(jié)直腸癌組織及正常對(duì)照組織間的表達(dá)差異。由GEO數(shù)據(jù)庫中獲得GSE6988和GSE20842數(shù)據(jù)集，2個(gè)數(shù)據(jù)集分別包含53、65個(gè)結(jié)直腸癌組織和28、65個(gè)癌旁組織。由表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)庫獲取59種不同的CRC細(xì)胞系中的表達(dá)數(shù)據(jù)，用以分析PTOV1在不同細(xì)胞系中的表達(dá)差異。

1.2.2PTOV1在CRC中的表達(dá)與預(yù)后分析： 基于TCGA-COADREAD數(shù)據(jù)庫的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)信息，根據(jù)PTOV1表達(dá)中位值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，繪制K-M生存曲線，用以評(píng)價(jià)PTOV1對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響。使用SPSS26.0軟件建立PTOV1表達(dá)量以及臨床病理特征與結(jié)直腸癌患者總生存期的多因素回歸模型，篩選出對(duì)CRC患者預(yù)后有顯著影響的因素。

1.2.3 細(xì)胞系培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染處理：將細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清及青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，每2～3 d傳代1次。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系在細(xì)胞解凍后傳代至少2代。使用Lipofec-tamine2000轉(zhuǎn)染試劑和100 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染。siRNA序列如下:siRNA-PTOV1:5′-GAGCAGGAGC AACAGCAAC-3′，siNC:5′-UGCUGUUGCUCCUGC UCCA-3′。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè) mRNA： 使用Trizol提取總RNA，按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，7500Fast實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀進(jìn)行RT-qPCR。以GAPDH為內(nèi)參，使用2- △△Ct方法評(píng)估m(xù)RNA的相對(duì)表達(dá)。引物序列如下：PTOV1：5′-GAAGATGCAATGACCGGGGA-3′，5′-CT AAAGCCCATGTAACCCTCTG-3′；GAPDH：5′-GGAG CGAGATCCCTCCAAAAT-3′，5′-GGCTGTTGTCATAC TTCTCATGG-3′。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白:使用RIPA細(xì)胞裂解液收集并裂解細(xì)胞，提取總蛋白。測(cè)定蛋白濃度并調(diào)勻各樣本蛋白濃度后，將等量的蛋白加入各泳道。經(jīng)PTOV1、GAPDH抗體及同種屬第二酶標(biāo)抗體孵育后，使用凝膠成像分析儀采集圖像。

1.2.6 集落形成檢測(cè)細(xì)胞增殖能力:轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×102個(gè)/孔接種于6孔板上培養(yǎng)14 d。4%多聚甲醛固定后，使用0.5%的結(jié)晶紫孵育30 min。隨后使用菌種計(jì)數(shù)儀觀察獲取圖像，用IMAGEJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.7 EdU形成檢測(cè)細(xì)胞增殖能力:CRC細(xì)胞系接種于24孔板上，按照EdU 染色試劑盒操作說明書進(jìn)行Apollo染色，使用 Hoechst 33342在黑暗中染色后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光并拍照。IMAGEJ軟件計(jì)算Apollo/Hoechst陽性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和可視化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，并采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 PTOV1在結(jié)直腸癌中表達(dá)水平的生物信息學(xué)分析

基于TCGA結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中638例結(jié)直腸癌組織和51例癌旁組織數(shù)據(jù)分析顯示：結(jié)直腸癌組織中PTOV1表達(dá)顯著下調(diào) (圖1A)，在51組配對(duì)結(jié)直腸癌與癌旁組織中，PTOV1在結(jié)直腸癌組織中的mRNA表達(dá)顯著低于癌旁組織(圖1B)。GEO數(shù)據(jù)庫中獲取了2個(gè)結(jié)直腸癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集均顯示，CRC組織中PTOV1mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(圖1C～D)。在59個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，PTOV1呈高表達(dá)狀態(tài)(圖1E)。

2.2 PTOV1在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中高表達(dá)

與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系相比，結(jié)腸癌細(xì)胞系中的PTOV1的蛋白和 mRNA水平均顯著上調(diào)(圖2A～B)。

2.3 PTOV1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與預(yù)后分析

PTOV1的表達(dá)水平與CRC患者的總體生存時(shí)間(overall survival， OS)、 無病生存時(shí)間(disease-free survival，DFS)和無進(jìn)展生存時(shí)間(progression-free survival，DFS)呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，高水平的PTOV1與CRC患者不良預(yù)后相關(guān)。多因素Cox生存分析顯示，年齡、T分型和PTOV1表達(dá)是CRC患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(P<0.05)(圖3)。綜上，PTOV1是一個(gè)預(yù)后不良因素和獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志。

A.PTOV1 mRNA expression levels in CRC and normal tissue samples analyzed in the TCGA databases; B.PTOV1 mRNA expression levels in CRC and paired normal tissue samples analyzed in the TCGA databases; C,D.PTOV1 mRNA expression levels in CRC and normal tissue samples analyzed in the GEO databases; E.PTOV1 expression in 59 different colorectal cancer cell lines， *P<0.001; PTOV1.prostate tumor over-expressed 1; CRC.colorectal cancer圖1 PTOV1在結(jié)直腸癌中表達(dá)水平的生物信息學(xué)分析Fig 1 Bioinformatics analysis of PTOV1 expression in colorectal cancer

A,B.protein and mRNA expression of PTOV1 in colorectal cancer cells lines (HT29, HCT116, RKO, SW480 and HCT15) and normal colon endothelial cell line (NCM460); *P<0.05 compared with NCM460;PTOV1.prostate tumor over-expressed 1圖2 PTOV1在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中高表達(dá)Fig 2 High expression level of PTOV1 in colorectal cancer cell lines

A-C.survival curves of OS, DFS and PFS in the colorectal cancer (n=368, n=132, n=363); D.forest plot illustrated the results of multivariate cox regression analyses; PTOV1.prostate tumor overexpressed 1; OS.overall survival; DFS.disease-free survival; PFS.progression-free survival圖3 PTOV1對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后的影響Fig 3 Prognosis capability of PTOV1 in colorectal cancer

2.4 敲低PTOV1表達(dá)抑制CRC細(xì)胞增殖

通過轉(zhuǎn)染特異性siRNA,在使得PTOV1在SW480細(xì)胞中表達(dá)降低 (圖4A～B)。PTOV1表達(dá)降低可抑制細(xì)胞增殖率，與正常對(duì)照組相比，敲低PTOV1表達(dá)組的集落數(shù)量和EdU陽性細(xì)胞明顯減少(圖4C～E)。上述結(jié)果表明PTOV1作為一種致癌基因促進(jìn)了CRC細(xì)胞增殖。

3 討論

結(jié)直腸癌作為世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤之一，由于CRC早期缺乏特異性的臨床癥狀或有效的生物標(biāo)志物，所以其預(yù)后較差[5]。雖然內(nèi)鏡篩查的普及和可用的多模式治療顯著提高了CRC患者的生存時(shí)間，但治療結(jié)果和預(yù)后仍不令人滿意。因此，尋找特異性和敏感性高的預(yù)后生物標(biāo)志物是結(jié)腸直腸癌早期發(fā)現(xiàn)和輔助治療的最有效途徑之一。

PTOV1作為癌基因在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著升高，其表達(dá)水平與前列腺癌預(yù)后和進(jìn)展顯著相關(guān)。在近年來的研究中，肝癌、乳腺癌、食管癌、宮頸癌等多種腫瘤均顯示，腫瘤組織中PTOV1表達(dá)明顯增高，作為預(yù)后的腫瘤生物標(biāo)志物和癌蛋白，在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[6-8]。此外，在侵襲性較強(qiáng)的腫瘤中，PTOV1表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)及預(yù)后相關(guān)，提示該蛋白是多種腫瘤潛在的預(yù)后標(biāo)志物[9]，然而PTOV1在結(jié)直腸癌中的作用還尚未闡明。本研究表明，PTOV1在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著升高并且與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。這提示PTOV1可能是結(jié)直腸癌潛在的致癌基因或重要的預(yù)后因素，并在CRC進(jìn)展過程中起到重要的調(diào)控作用。

多項(xiàng)研究表明，PTOV1是一種有絲分裂蛋白，以周期依賴的方式在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，在細(xì)胞周期調(diào)控中起決定性作用[10]。在靜息狀態(tài)下，PTOV1主要位于核周。在S期初期，PTOV1部分轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，而在有絲分裂末期，PTOV1離開細(xì)胞核[11]。此外，也有報(bào)道稱，PTOV1通過激活Wnt/β-catenin、NF-kappa B和cJUN通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[8,12]。本研究中發(fā)現(xiàn)抑制PTOV1表達(dá)顯著抑制CRC細(xì)胞集落形成數(shù)及EdU陽性細(xì)胞數(shù)，降低CRC細(xì)胞增殖能力。這一發(fā)現(xiàn)也進(jìn)一步證實(shí)PTOV1是細(xì)胞增殖過程中調(diào)控分子。但PTOV1調(diào)控CRC細(xì)胞增殖的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

A,B.the protein and mRNA expression level of PTOV1 in SW480 cells with transfected PTOV1 siRNA; C.colony formation assays of SW480 after PTOV1 knockdown; D,E.representative image of EdU incorporation and quantification of EdU-positive cells treated by PTOV1 knockdown; scale bar=200 μm; *P<0.05 compared with NC; PTOV1.prostate tumor over-expressed 1圖4 PTOV1促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖Fig 4 PTOV1 facilitated CRC cell proliferation

綜上，本研究綜合生物信息學(xué)分析和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PTOV1是一個(gè)與結(jié)直腸癌預(yù)后不良相關(guān)的癌基因，可能與其促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究PTOV1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用提供了新的視角與線索。