干擾TLR4對LPS感染雞HD11細(xì)胞免疫炎癥的影響

李 歡,孫紅艷,于智勇,孫長花,2

(1.揚州市職業(yè)大學(xué) 生物與化工工程學(xué)院，揚州 225012；2.揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州225009；3.中國教育部國際農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全研究聯(lián)合實驗室，揚州 225009)

Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)是存在于免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞等)膜上或細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞受體，它們通過識別細(xì)胞外病原體相關(guān)分子結(jié)構(gòu)而發(fā)揮非常重要的作用[1]。例如，樹突狀細(xì)胞可通過Toll樣受體識別病原體結(jié)構(gòu)，激活適應(yīng)性免疫，確定T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫類型、特異性和持續(xù)時間[2]。巨噬細(xì)胞表面受體TLR可識別結(jié)核分枝桿菌的結(jié)構(gòu)以激活胞內(nèi)NF-κB等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)特異性基因表達(dá)，促進天然和特異性免疫炎癥反應(yīng)[3-4]。目前，在雞中已鑒定出10個Toll樣受體家族成員[5]：其中TLR2A、TLR2B、TLR3、TLR4、TLR5和TLR7與哺乳動物同源；TLR21與魚類和兩棲動物相似；而TLR1LA、TLR1LB和TLR15是雞中特有的Toll樣受體。

家禽生產(chǎn)中常見疾病(禽大腸桿菌病、禽白痢、禽霍亂等)均由革蘭氏陰性細(xì)菌引起，發(fā)病率高達(dá)30%～60%，死亡率為10%～30%，每年造成數(shù)億元損失[6]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌致病關(guān)鍵因子，可激活炎性細(xì)胞表達(dá)，產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)。研究表明LPS感染雛雞后，肝臟中促炎因子基因TNF-α、IL1β和抗炎因子基因TGF-β表達(dá)水平均發(fā)生顯著性變化[7]。目前，已發(fā)現(xiàn)Toll樣受體家族成員TLR4是識別革蘭氏陰性菌LPS的主要受體[8]。在人和鼠中，TLR4既可通過髓樣分化因子88(MyD88)依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與免疫反應(yīng)，產(chǎn)生炎性因子IL-6、IL-8和IL1β，又能通過MyD88非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生IFN-β。隨后，Richze團隊[9]發(fā)現(xiàn)LPS感染小鼠時TLR4可通過MyD88依賴和非依賴信號通路產(chǎn)生IFN-α細(xì)胞因子進行免疫。但與哺乳動物不同，LPS感染僅能激活雞中TLR4的MyD88依賴性信號通路，產(chǎn)生炎性因子IL-1β和IL-8；不能激活MyD88非依賴性通路，不能產(chǎn)生IFN-β[10]。這說明雞體內(nèi)缺乏功能性LPS-特異的TLR相關(guān)分子-TLR相關(guān)干擾素活化子(TRAM-TRIF)信號通路，只能依靠MyD88依賴性信號通路在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。

雞TLR4位于17號染色體，包含3個外顯子，CDS區(qū)長度為2 532 bp，編碼843個氨基酸，在骨髓、胸腺、脾臟、法氏囊、卵巢、肝臟、肺臟、氣管等組織或器官中都有高表達(dá)[11-17]。早期關(guān)于TLR4的研究主要集中在人和小鼠中的免疫反應(yīng)[18-19]，之后多集中于TLR4在癌細(xì)胞的增殖和凋亡、器官移植、傷口愈合等過程中的作用[20]。盡管TLR4在人和鼠中已經(jīng)有了較多研究，但其在家禽中的功能機制還尚未開展。雞TLR4和人TLR4的同源性小于50%，存在物種特異性且其信號通路有差異。近期的轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)雞TLR4及其信號通路在禽致病性大腸桿菌或禽腸炎沙門氏桿菌感染時都會發(fā)生顯著性變化[15-17]，但對雞TLR4在免疫細(xì)胞中的功能機制研究較少。

以雞巨噬細(xì)胞HD11和鼠傷寒沙門氏桿菌衍生的脂多糖LPS為研究材料，利用TLR4基因過表達(dá)和干擾、qRT-PCR、Western Blot和細(xì)胞凋亡檢測等技術(shù)和方法分析雞TLR4在細(xì)胞免疫炎癥中的作用，為控制過度炎癥反應(yīng)提供新思路和干預(yù)靶點，對緩解應(yīng)激性病理損傷和提高家禽健康具有實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

雞巨噬細(xì)胞HD11來自揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳實驗室。RPMI-1640培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶消化液均購自美國Gibco公司；Silencer?select siRNA試劑盒、NE-PERTMNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents試劑盒、Pierce?BCA Protein Assay Kit試劑盒、RNAlater?RNA Stabilization Solution購自Thermo Fish Scientific公司；RNAqueous?Kit 試劑盒和DNA-freeTMDNA Removal Kit購自Gibco公司；Thermoscript RT-PCR試劑盒、LipofectamineTMRNAiMAX、BLOCK-iTTMAlexa Fluor?購自Invitrogen；QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit試劑盒購自Qiagen公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LPS購自Sigma公司；兔抗雞TLR4及兔抗雞 β-actin抗體購自Abcam公司，羊抗兔IgG二抗購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

雞巨噬細(xì)胞HD11移入RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)臺盼藍(lán)染色后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞活力為90%～95%時用于后續(xù)試驗。

1.2.2 RNA干擾

根據(jù)雞TLR4基因的不同外顯子，利用BLOCK-iTTMRNAi Designer設(shè)計3個siRNA，分別為siRNA-1、siRNA-1-2和siRNA-1-3。siRNA-1：5′-CAGUCUGGUCUUGCUAGACAUUUUCU-3′，siRNA-2：5′-CAGUAGCAUGCUCAGUGACUGUGUGU-3′，siRNA-3：5′-CCGAU-AUCUGAGGAGGAACACUUAU-3′。引物由上海生工生物公司合成。按照Silencer?select siRNA試劑盒說明書，將5組siRNA(siRNA-1，siRNA-2，siRNA-3，siRNA-1、-2、-3混合和陰性對照)(0.1 μmol/L)分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染6 h后熒光顯微鏡下用BLOCK-iTTMAlexa Fluor?紅色熒光質(zhì)控劑(20 μmol/L)評估轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 LPS刺激HD11細(xì)胞

轉(zhuǎn)染24 h后，不同濃度(0.1、0.5、1.0或5 μg/mL)LPS感染雞巨噬細(xì)胞HD11，0 μg/mL LPS為對照組。感染2、4、8和12 h后，收集細(xì)胞并放入RNAlater?RNA Stabilization Solution，4 ℃過夜；后將樣品儲存于-80 ℃，以備后續(xù)RNA提取實驗。

1.2.4 RNA分離和DNA酶處理

利RNAqueous?Kit試劑盒分離RNA。后用DNA-freeTMDNA Removal Kit處理總RNA。RNA質(zhì)量和數(shù)量分別通過Nanodrop、瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計進行檢測。

1.2.5 qRT-PCR實驗

用Thermoscript RT-PCR試劑盒將不同處理組總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用7300實時PCR儀和QuantiTect SYBR Green RT-PCR試劑盒，以cDNA為模板，進行實時熒光定量RT-PCR擴增。qRT-PCR分析候選基因TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-8、IFN-α以及標(biāo)準(zhǔn)化基因GAPDH的mRNA表達(dá)量。擴增體系(總體積為25 μL)：cDNA 1 μL，QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix(2×)12.5 μL，QuantiTect RT Mix 0.25 μL，上游下游引物(表1)各1 μL，ddH2O 9.25 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。每個循環(huán)結(jié)束時檢測熒光信號，以每1 s上升1 ℃的速度從70 ℃升高到90 ℃，進行熔解曲線分析，獲得每個樣本的Ct值，根據(jù)公式ΔΔCt=40-[(檢測基因的平均Ct值)+(GAPDH的中位Ct值-GAPDH的平均Ct值)×(檢測基因的斜率/GAPDH的斜率)]。通過2-ΔΔCt法計算各基因mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.6 Western Blot實驗

根據(jù)NE-PERTMNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白。主要過程為去除培養(yǎng)瓶中上清培養(yǎng)液，PBS清洗3次，分別用包漿蛋白裂解液I和II漂洗細(xì)胞，去除裂解液。轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，14 000 r/min離心5 min后取上清液。利用BCA Protein Assay Kit試劑盒測定蛋白濃度。對檢測后的蛋白質(zhì)樣品進行120 V、4 ℃條件的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜PVDF 90 min，3%牛血清白蛋白封閉2 h；加入目的蛋白(TLR4和β-actin)一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜；后TBST洗滌(3～4次，10 min/次)，加入辣根過氧化酶標(biāo)記抗體(二抗，1∶2 000)孵育2 h，經(jīng)ECL試劑顯色，化學(xué)發(fā)光顯影。以β-actin作為內(nèi)參對照基因，用凝膠成像系統(tǒng)進行顯影檢測TLR4蛋白表達(dá)情況。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

利用碧云天Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒分析不同處理組細(xì)胞凋亡率。將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，48 h后吸取細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管，PBS洗滌，加入胰酶消化細(xì)胞；收集細(xì)胞培養(yǎng)液并吹打細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS重洗細(xì)胞并計數(shù)；取5～10萬個細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC，混勻；加入10 μL PI染色液，混勻；室溫避光10～20 min后立即用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

經(jīng)qRT-PCR檢測后，利用JMP統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。固定效應(yīng)為siRNA、處理組、時間以及各效應(yīng)間的相互作用。隨機效應(yīng)為樣品批次。利用JMP軟件對siRNA、處理組、時間效應(yīng)最小二乘(Least squares method,LS)平均值進行多重比較。采用圖基真實顯著差異[Tukey’s honestly significant difference(Tukey HSD)]算法來確定顯著性差異。顯著水平為P<0.05；極顯著水平為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS劑量和處理時間對雞TLR4及其相關(guān)基因表達(dá)的影響

為確定鼠傷寒沙門氏桿菌衍生的LPS感染雞巨噬細(xì)胞HD11的最佳劑量和時間，通過qRT-PCR檢測TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-8和IFN-α基因在不同感染時間和感染劑量時mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LPS不同劑量和感染時間均可顯著性影響細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，劑量和時間之間無顯著互作(表2)。

表2 LPS劑量和感染時間對雞HD11細(xì)胞中免疫相關(guān)基因應(yīng)答的影響Table 2 Effect of LPS dose and infection time on the expression of immune related genes in chicken HD11 macrophages (P values)

與對照組相比，0.5 μg/mL LPS可顯著性誘導(dǎo)雞巨噬細(xì)胞HD11發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)(圖1)；1 μg/mL LPS誘導(dǎo)基因TLR4、IL-1β、IL-8和IL-6表達(dá)量在感染8 h后達(dá)到峰值(圖1)；5 μg/mL LPS在感染8 h后使基因TNF-α、TGF-β和IFN-α的表達(dá)量達(dá)到最高值，但與劑量為1 μg/mL LPS相比差異不顯著(圖1)。因本研究旨在驗證LPS感染時雞巨噬細(xì)胞HD11中TLR4基因功能，故選擇LPS劑量為1 μg/mL、感染時間為8 h用于后續(xù)功能鑒定實驗。

(a)LPS感染2 h后免疫相關(guān)基因表達(dá)量；(b)LPS感染4 h后免疫相關(guān)基因表達(dá)量；(c)LPS感染8 h后免疫相關(guān)基因表達(dá)量；(d)LPS感染12 h后免疫相關(guān)基因表達(dá)量。圖中不同字母(a、b、c和d)代表不同組間差異顯著(P<0.05)；相同字母代表差異不顯著(P>0.05)。圖1 LPS感染雞巨噬細(xì)胞HD11后TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-8和IFN-α 基因的表達(dá)量變化Figure 1 Changes in gene expression of TLR4,IL-1β,IL-6,TNF-α,TGF-β,IL-8 and IFN-α in chicken HD11 cells infected by LPS

2.2 siRNA干擾TLR4基因

siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染效率為86.28%±1.08%(圖2)；存在熒光標(biāo)記，表明siRNA已成功轉(zhuǎn)染至雞巨噬細(xì)胞HD11[圖2(c)]。不同干擾載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，結(jié)果顯示基因TLR4mRNA表達(dá)量在TLR4-siRNA-2和空白對照組之間存在顯著性差異(P<0.05)；在TLR4-siRNA-3和空白對照組之間存在極顯著性差異(P<0.01)。TLR4-siRNA-2和TLR4-siRNA-3均能對TLR4基因產(chǎn)生不同程度的沉默，干擾效率分別為62%和76%[圖3(a)]，TLR4-siRNA-3沉默效果最為顯著。同時，進一步檢測到TLR4-siRNA-3組TLR4蛋白表達(dá)量顯著性降低[圖3(b)和(c)]。因此，TLR4-siRNA-3沉默基因TLR4表達(dá)的效果最佳，最終確定TLR4-siRNA-3用于后續(xù)實驗。

(a)普通燈下細(xì)胞狀態(tài)；(b)熒光燈下細(xì)胞狀態(tài)；(c)為(a)和(b)的合并圖像。圖2 熒光siRNA轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞狀況(標(biāo)尺100 μm)Figure 2 The morphology of cells after fluorescent siRNA transfection 24 h (scale 100 μm)

(a)不同處理組轉(zhuǎn)染雞HD11細(xì)胞后TLR4 mRNA的表達(dá)水平；(b)TLR4-siRNA-3轉(zhuǎn)染雞HD11細(xì)胞后Western Blot檢測TLR4蛋白的表達(dá)；(c)Western Blot評估TLR4-siRNA-3轉(zhuǎn)染的雞HD11細(xì)胞和兩個對照細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)的水平。圖中不同字母(a、b、c和d)代表不同組間差異顯著(P<0.05);相同字母代表差異不顯著(P>0.05)。圖3 siRNA敲低TLR4后在雞HD11細(xì)胞中的表達(dá)Figure 3 The expression of TLR4 in chicken HD11 cells after siRNA knockdown

2.3 LPS感染時干擾TLR4對細(xì)胞免疫炎性基因表達(dá)的影響

以GAPDH為內(nèi)參基因，qRT-PCR檢測 LPS感染siRNA干擾TLR4基因的雞HD11細(xì)胞免疫和炎性相關(guān)基因表達(dá)量的影響。由圖4可知，與對照組相比，基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)量在TLR4-siRNA-3轉(zhuǎn)染的雞HD11細(xì)胞中顯著性下降，其表達(dá)模式與基因TLR4一致(P<0.05)；而基因TGF-β和IFN-α相對表達(dá)量下降不顯著(P>0.05)，見圖4。LPS感染時，TLR4-siRNA-3組中TLR4表達(dá)量顯著性低于對照組；IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)趨勢與TLR4一致；而TGF-β和IFN-α的相對表達(dá)量差異不顯著。

圖中不同字母(a、b、c和d)代表不同組間差異顯著(P<0.05)；相同字母代表差異不顯著(P>0.05)。圖4 LPS(1 μg/mL)感染8 h后，TLR4-siRNA-3轉(zhuǎn)染的雞HD11細(xì)胞中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β和IFN-α基因表達(dá)量變化Figure 4 The expression level of TLR4,IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-α,TGF-β and IFN-α in chicken HD11 macrophages transfected with TLR4-siRNA-3 after 8 h of LPS (1 μg/mL) infection

2.4 干擾TLR4基因抑制LPS感染的雞HD11細(xì)胞凋亡

(a)對照組細(xì)胞凋亡分布；(b) LPS感染組細(xì)胞凋亡分布；(c)干擾TLR4基因的LPS感染組細(xì)胞凋亡分布；(d) 對照組、LPS感染組和干擾TLR4的LPS感染組細(xì)胞凋亡率。圖中不同字母(a、b和c)代表不同組間差異顯著(P<0.05)；相同字母代表差異不顯著(P>0.05)。圖5 干擾TLR4基因?qū)PS感染的雞HD11細(xì)胞凋亡的影響Figure 5 Effect of interference with TLR4 gene on apoptosis of chicken HD11 macrophage after LPS infection

利用流式細(xì)胞儀檢測LPS感染前后干擾TLR4后細(xì)胞凋亡率。相比對照組(91.56%)，LPS感染組活細(xì)胞數(shù)量(71.12%)顯著下降，而干擾基因TLR4后活細(xì)胞數(shù)量(83.16%)有所增加(圖5)。LPS感染組總細(xì)胞凋亡率為27.49%，相比對照組的6.96%差異顯著(P<0.05)；而干擾TLR4后感染LPS，總細(xì)胞凋亡率降為15.15%，與LPS感染組和對照組均差異顯著(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，作為內(nèi)毒素可作用于人或動物的各種細(xì)胞，激活免疫反應(yīng)。Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)0.5 μg/mL大腸桿菌O55：B5衍生的LPS可顯著激活肉雞免疫反應(yīng)；而Van Goor等[22]的研究顯示0.2 μg/mL腸炎沙門氏桿菌衍生的LPS誘導(dǎo)雞巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)的效果最佳；Michailidis等[23]證實1 μg/mL大腸桿菌O111：B4衍生的LPS對雞睪丸支持細(xì)胞的感染效果最優(yōu)。這些研究表明不同來源的LPS以及不同劑量的LPS對細(xì)胞免疫反應(yīng)激活程度不同。研究通過劑量梯度試驗證明1 μg/mL鼠傷寒沙門氏桿菌衍生的LPS能最有效激活TLR4信號通路并促進炎癥細(xì)胞因子基因表達(dá)。同時，前期已證實雞巨噬細(xì)胞HD11在感染禽致病性大腸桿菌6 h后開始大量凋亡[24]。Sipos 等[25]研究發(fā)現(xiàn)LPS感染細(xì)胞6、12和24 h后，可激活TLR4信號傳導(dǎo)。研究通過時間梯度試驗證明1 μg/mL 鼠傷寒沙門氏桿菌衍生的LPS在感染8 h 后TLR4及其相關(guān)的免疫炎癥基因表達(dá)水平變化極顯著且達(dá)到峰值。

目前，研究已證明敲除TLR4基因的小鼠會降低免疫反應(yīng)，改善同種異體移植排斥反應(yīng)[7]。同時發(fā)現(xiàn)干擾TLR4可調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡[8]，表明TLR4可能是肝癌治療的潛在靶標(biāo)。在傷口修復(fù)中發(fā)現(xiàn)，小鼠中敲除TLR4基因可顯著性降低TNF、IL6和IL10基因的表達(dá)水平[19]，有利于傷口愈合。在LPS感染的小鼠中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TLR4可以加劇肺臟炎癥的損傷[26]。上述研究結(jié)果表明，TLR4對炎癥反應(yīng)的緩解以及其TLR4/MyD88通路對宿主免疫的調(diào)節(jié)都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡。因此，本研究成功干擾TLR4基因后，發(fā)現(xiàn)LPS感染雞巨噬細(xì)胞HD11時促炎因子基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)量顯著性降低，且有效抑制雞HD11細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果表明雞TLR4基因?qū)Υ傺仔砸蜃踊虻谋磉_(dá)有正向調(diào)節(jié)作用；干擾TLR4基因可以積極緩解雞HD11細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。此結(jié)果與前期研究結(jié)果一致，即雞TLR4基因只能依賴TLR4/MyD88信號傳導(dǎo)通路參與免疫，進而激活NF-κB信號通路，產(chǎn)生免疫炎性因子IL-8、IL-6、IL-1β和TNF[27-28]。TLR4作為LPS的受體之一，干擾TLR4基因可能降低了內(nèi)毒素LPS結(jié)合受體的能力，減少了感染概率，從而降低了免疫反應(yīng)和炎性因子基因的表達(dá)。具體雞TLR4基因以何種方式發(fā)揮調(diào)控功能，仍需進一步研究。

盡管前期已有報道證明在各種疾病中TLR4與TGF-β或IFN-α基因之間存在聯(lián)系。例如：在膀胱移行細(xì)胞癌T24中存在TLR4與TGF-β的相互作用[29]；TLR4可通過TGF-β介導(dǎo)前列腺增生[30]；TLR4可增強IFN-α的抗病毒效益[31]；在LPS感染小鼠時TLR4信號通路可產(chǎn)生IFN-α細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)[32]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)LPS感染干擾TLR4基因的雞巨噬細(xì)胞HD11時，抗炎因子基因TGF-β和IFN-α的表達(dá)水平均不受影響，其趨勢與TLR4不同。此結(jié)果進一步驗證雞TLR4只能通過TLR4/MyD88信號通路發(fā)揮作用，且與鼠TLR4作用機制不同，不能調(diào)控IFN-α基因的表達(dá)；同時，從側(cè)面證明雞TLR4基因可能是通過調(diào)節(jié)促炎性因子基因的表達(dá)，而非抗炎性因子基因的表達(dá)，來緩解過度炎癥反應(yīng)。

總之，干擾雞TLR4基因能夠負(fù)向調(diào)節(jié)雞巨噬細(xì)胞HD11中促炎因子基因表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡；但不調(diào)節(jié)抗炎性因子基因表達(dá)。研究結(jié)果同時表明雞TLR4基因的表達(dá)水平是內(nèi)毒素LPS引起細(xì)胞炎癥反應(yīng)的一個限制性因素。調(diào)節(jié)TLR4基因的表達(dá)可直接影響細(xì)胞對內(nèi)毒素LPS的炎癥反應(yīng)。小分子化合物局部抑制TLR4基因的表達(dá)可能為控制過度炎癥反應(yīng)提供新思路和干預(yù)靶點，對緩解應(yīng)激性病理損傷和提高家禽健康具有實踐意義。