雨生紅球藻蝦青素納米顆粒的制備及穩(wěn)定性研究

袁巧月，吳 梵，王孝治，趙 軒,，崔 莉，羅海波，陶明煊，劉 琛,，郭宇星,

（1.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇南京 210023；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014）

蝦青素（3,3’-二羥基-4,4’-二酮-β,β’胡蘿卜素，astaxanthin）是一種類胡蘿卜素[1]，屬于萜烯類不飽和化合物，是在自然界有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)的抗氧化能力極強(qiáng)的物質(zhì)[2]。雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種新資源食品，被公認(rèn)為天然蝦青素最好的生物來源，受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注[3]。然而其具有較厚的細(xì)胞壁，對(duì)機(jī)械和化學(xué)物質(zhì)都具有極強(qiáng)的抵抗力，阻礙了蝦青素的提取，因此常采用生物酶法對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行破壁處理來提取蝦青素[4]。蝸牛酶作為一種包含果膠酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等多種酶的混合酶，可用于酵母和雨生紅球藻的破壁研究[5]。

蝦青素具有極強(qiáng)的抗氧化性，在光和熱等條件下不穩(wěn)定且不溶于水，為了提高蝦青素在食品中的穩(wěn)定性和生物利用度，常通過乳液[6]、脂質(zhì)體[7]、微囊化[8]和納米顆粒[9]等技術(shù)對(duì)蝦青素進(jìn)行包埋處理。食品級(jí)蛋白質(zhì)因其具有天然來源、無毒且高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的特點(diǎn)，在提高脂溶性活性物質(zhì)的生物利用度方面得到廣泛的應(yīng)用，如玉米醇溶蛋白[10]、β-乳球蛋白[11]、酪蛋白[12]等。乳脂肪球膜的各組分具有兩親性，可用來作為天然的乳化劑，主要成分為特異性膜蛋白和磷脂，其中蛋白質(zhì)含量在25%～70%，主要的乳脂肪球膜蛋白包括有嗜乳脂蛋白、黏液素、黃嘌呤氧化還原酶、乳凝集素等[13]。然而，由單一蛋白質(zhì)制成的納米顆粒封裝通常不穩(wěn)定，在胃腸消化中會(huì)被蛋白酶降解，破壞納米顆粒結(jié)構(gòu)，因此蛋白質(zhì)基通常需要涂上一層其他化合物，以提高穩(wěn)定性和封裝效率，大多情況下會(huì)與多糖復(fù)合以達(dá)到更佳效果[14]。阿拉伯膠作為一種兩親性多糖[15]，是一種攜帶羧基的弱聚電解質(zhì)，可以通過靜電相互作用與帶正電的粒子交聯(lián)，因其較高的溶解性和較低的黏度，易與大分子間粘合，故常被用作食品乳化劑和穩(wěn)定劑。乳脂肪球膜蛋白的分子量為48～225 kDa，高于β-乳球蛋白和酪蛋白，高分子量蛋白質(zhì)比低分子量蛋白質(zhì)具有更高的覆蓋率，這可以提高運(yùn)載體系的穩(wěn)定性[16]。此外，乳脂肪球膜被認(rèn)為是制備富含β-胡蘿卜素的O/W 乳液的理想材料[17]。

基于此，本研究通過蝸牛酶對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行酶解破壁提取蝦青素，并以富含乳脂肪球膜的乳清蛋白粉與阿拉伯膠制備蝦青素納米顆粒，選擇最佳的pH、蛋白與阿拉伯膠質(zhì)量比以及蝦青素添加濃度；通過蝦青素納米顆粒的傅里葉紅外光譜分析和貯藏穩(wěn)定性，探究該納米顆粒的性質(zhì)，為蝦青素在食品、藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma 公司；雨生紅球藻粉（蝦青素含量4%）昆明白鷗微藻技術(shù)有限公司；蝸牛酶（含有纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等20 多種酶）生工生物工程（上海）股份有限公司；無水乙醇 南京化學(xué)試劑股份有限公司；乳清蛋白粉（富含乳脂肪球膜）美國(guó)Hilmar 公司；阿拉伯膠 上海麥克林生化科技有限公司；所有試劑均為分析純。

Zetasizer Nano-ZS 納米粒度及電位儀 英國(guó)馬爾文公司；GL-22M 型高速冷凍離心機(jī) 上海趙迪生物科技有限公司；MCFD5005 型真空冷凍干燥機(jī)上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海新苗醫(yī)療器械有限公司；Nexus 670 型傅里葉變換紅外光譜 美國(guó)尼高力公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雨生紅球藻蝦青素的酶法提取工藝 參考張曄等[18]和Duan 等[19]的方法，稍加修改。按2%（w/v）稱取一定量雨生紅球藻粉至0.2 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，調(diào)節(jié)pH 至6.0，加入0.4 mg/mL 的蝸牛酶于35 ℃下酶解反應(yīng)4 h，結(jié)束后進(jìn)行75 ℃滅酶處理5 min[20]，取酶解后的殘?jiān)?.5%（w/v）加入無水乙醇，在50 ℃水浴鍋中提取1 h，收集上清液，重復(fù)操作直至上清液澄清，用0.45 μm 針頭式過濾器過濾備用[21]。

1.2.2 蝦青素納米顆粒的制備

1.2.2.1 pH 的選擇 參照Liu 等[22]的方法，將蛋白粉溶于超純水制備1 mg/mL 的溶液，500 r/min 于25 ℃攪拌30 min 后，用1.0 mol/L 的HCl 調(diào)節(jié)pH 至4，繼續(xù)攪拌60 min。加入阿拉伯膠使得體系終濃度為1.5 mg/mL，以500 r/min 攪拌60 min。將體系的pH 調(diào)至2～7 之間（2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7）[23]，繼續(xù)攪拌2 h，置于4 ℃冰箱過夜，以確保充分水化。使用馬爾文Nano-ZS 電位及納米粒度分析儀在25 ℃測(cè)定各體系的Zeta 電位值[24]。

在固定壁材總濃度為0.15%，蛋白與阿拉伯膠質(zhì)量比為2:1，蝦青素添加濃度為60 μmol/L 的情況下，調(diào)節(jié)體系的pH 至2.5、3.0、3.5、4.0 和4.5，繼續(xù)攪拌2 h。參考Huang 等[25]的方法，取36 mg 蝦青素凍干品溶于360 μL 食品級(jí)乙醇中，得到0.1 g/mL的蝦青素-乙醇母液，將其分散到上述各體系以獲得蝦青素終濃度為60 μmol/L 的分散體，渦旋5 min 后避光攪拌60 min，測(cè)定包封率。

1.2.2.2 壁材比例的選擇 在固定壁材總濃度為0.15%，pH 為4.0，蝦青素添加量為60 μmol/L 的情況下，參照牛付閣[26]的方法，考察不同的蛋白與阿拉伯膠質(zhì)量比（1:4、1:2、1:1、2:1 和4:1）對(duì)蝦青素包埋效果的影響。

1.2.2.3 蝦青素濃度的選擇 在固定壁材總濃度為0.15%，pH 為4.0，蛋白與阿拉伯膠質(zhì)量比為2:1 的情況下，考察蝦青素的不同添加量（20、40、60、80 和100 μmol/L）對(duì)蝦青素包埋效果的影響[22,25]。

1.2.2.4 蝦青素包封率的測(cè)定 根據(jù)Hu 等[27]的方法，稍作修改。將1.0 mL 納米顆粒與1.0 mL 無水乙醇混合后，以10000 ×g 離心10 min，收集上清液，重復(fù)操作至上清液呈無色。其中，游離蝦青素含量是指上清液中未結(jié)合的蝦青素含量，將收集的上清液合并，用紫外可見分光光度計(jì)于476 nm 處測(cè)量吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（y=0.1051x+0.1038，R2=0.9963）計(jì)算蝦青素的含量。包封率按下列公式計(jì)算。

1.2.3 雨生紅球藻蝦青素納米顆粒的性質(zhì)研究

1.2.3.1 傅里葉紅外光譜 根據(jù)Zhang 等[28]的方法，稍作修改。取1 mg 蝦青素納米顆粒凍干品放置于瑪瑙研缽中，加入100 mg 的干燥溴化鉀粉末，均勻研磨后，壓制成透明的樣品片，累計(jì)掃描32 次，儀器分辨率為4 cm-1，光譜掃描范圍為4000～500 cm-1。

1.2.3.2 貯藏穩(wěn)定性 在已優(yōu)化的條件下制備蝦青素納米分散體，將其放置于4、25 和37 ℃環(huán)境下避光保存[29]，分別在0、5、10 和15 d 時(shí)測(cè)量其粒徑、Zeta 電位、蝦青素保留率和DPPH 清除能力。

1.2.3.3 粒徑和Zeta 電位的測(cè)定 按照方法1.2.2.1進(jìn)行。

1.2.3.4 蝦青素保留率的測(cè)定 參照謝灝婷[30]的方法，稍作修改。取1 mL 納米顆粒溶液置于離心管中，加入5 mL 無水乙醇，旋渦振蕩器振蕩60 s，以充分萃取顆粒內(nèi)的蝦青素，振蕩結(jié)束后10000×g 離心10 min，收集上清液，重復(fù)操作至上清液呈無色，在476 nm 處測(cè)量吸光度。蝦青素保留率按下列公式計(jì)算。

式中：V 表示上清液合并后的體積，mL；C1表示蝦青素濃度，μg/mL；m 表示所用的蝦青素質(zhì)量，mg。

1.2.3.5 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)組為200 μL 蝦青素納米顆粒與800 μL 的0.2 mmol/L DPPH 混合，暗處反應(yīng)30 min 后于517 nm 測(cè)定吸光值；空白對(duì)照組為無水乙醇溶液代替DPPH，對(duì)照組為200 μL 無水乙醇與800 μL DPPH 混合測(cè)定的吸光值[31]。

式中：Ai表示實(shí)驗(yàn)組吸光值；Aj表示空白組吸光值；A0表示對(duì)照組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA和Duncan 分析，通過Origin 8.0、Design Eepert 8.0.6和Graphpad 8.0 做圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 雨生紅球藻蝦青素納米顆粒制備工藝研究

2.1.1 納米顆粒pH 的選擇 通過考察體系的Zeta電位，分析蛋白質(zhì)和多糖復(fù)合凝聚的作用力。如圖1所示，當(dāng)pH 從7.0 降至2.0 時(shí)，蛋白質(zhì)的電位值從-32.03±0.09 mV 增加到+17.27± 0.14 mV，當(dāng)pH 小于4.5 時(shí)，蛋白質(zhì)所帶電荷由負(fù)轉(zhuǎn)正。單一的阿拉伯膠溶液也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，在降到pH2.1 時(shí)開始由負(fù)轉(zhuǎn)正，這可能是因?yàn)閜H 在低于阿拉伯膠側(cè)鏈基團(tuán)的解離常數(shù)時(shí)，側(cè)鏈上的羧基基團(tuán)被質(zhì)子化而帶有部分正電荷[26]。當(dāng)?shù)鞍着c阿拉伯膠帶相反電荷時(shí)，兩者之間才有可能發(fā)生復(fù)凝聚反應(yīng)，隨著溶液pH 降低，蛋白多糖復(fù)合體系的電位值持續(xù)變大，經(jīng)靜電相互作用而發(fā)生復(fù)合凝聚。因此，制備蝦青素納米顆粒的最佳pH 范圍應(yīng)在2.5～4.5 之間。

圖1 蛋白、阿拉伯膠及復(fù)合體系的Zeta 電位隨pH變化的情況Fig.1 Variation of Zeta potential of proteins,gum arabic and composite systems with pH

如圖2 所示，不同pH 條件下的蝦青素納米顆粒包封率不同，在pH 為2.5～4.0 之間，包封率隨pH 的增加而增加，這是因?yàn)榘⒗z帶有較多的負(fù)電荷，蛋白的正電荷減少，兩者能夠很好地交聯(lián)，當(dāng)pH 為4.0 時(shí)，蝦青素包封率高達(dá)92.93%±0.19%。隨著pH繼續(xù)增加至4.5 時(shí)，蛋白到達(dá)等電點(diǎn)，與帶負(fù)電荷的阿拉伯膠交聯(lián)程度不夠，因而包封率降低。周慶新等[32]在探究pH 對(duì)蝦青素酯包埋率的影響時(shí)，也確定pH4.0 為制備蝦青素酯微膠囊的最佳條件。本文的研究結(jié)果與暴莎莎[33]在研究不同pH 對(duì)南極磷蝦油微膠囊的形成和產(chǎn)率影響類似。所以，pH4.0 為蝦青素納米顆粒的最佳制備條件。

圖2 不同pH 對(duì)蝦青素包封率的影響Fig.2 Effect of different pH values on the encapsulation rate of astaxanthin

2.1.2 納米顆粒壁材比例的選擇 由圖3 可看出，蛋白與阿拉伯膠的配比對(duì)蝦青素包封率存在較大影響。從數(shù)據(jù)上來看，當(dāng)?shù)鞍着c阿拉伯膠質(zhì)量比從1:4增加至2:1 時(shí)，蝦青素包封率由74.61%±0.25%增至92.93%±0.19%，而繼續(xù)增加蛋白用量時(shí)，包封率開始呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，下降至81.40%±0.92%。這種變化是體系中阿拉伯膠的數(shù)量減少，阿拉伯膠糖鏈被蛋白飽和吸附，從而導(dǎo)致蝦青素包封率降低。謝灝婷[30]發(fā)現(xiàn)了增大薏米醇溶蛋白與阿拉伯膠配比，蝦青素包封率先增大后減小，這與本文的研究類似。所以最佳的蛋白與阿拉伯膠配比為2:1。

圖3 不同蛋白與阿拉伯膠質(zhì)量比對(duì)蝦青素包封率的影響Fig.3 Effect of protein to gum arabic mass ratios values on the encapsulation rate of astaxanthin

2.1.3 納米顆粒蝦青素濃度的選擇 由圖4 可知，當(dāng)固定其他因素不變，隨著蝦青素的投入量增加，包封率先增大后減小。當(dāng)蝦青素濃度為20 μmol/L 增加至60 μmol/L 時(shí)，包封率從64.87%±0.22%增加至92.93%±0.19%，而當(dāng)繼續(xù)增加蝦青素投入量時(shí)，蛋白與阿拉伯膠分子和蝦青素的結(jié)合已經(jīng)飽和，超過了一定的負(fù)荷，降低了蝦青素的包封率。胡方斌[34]在研究蝦青素濃度對(duì)蝦青素PLGA 納米粒制備的影響時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了蝦青素濃度與包封率大小先成正相關(guān)而后呈負(fù)相關(guān)。因此，本文選擇60 μmol/L 的濃度制備蝦青素納米顆粒。綜上，蝦青素納米顆粒的最佳制備條件是：pH 為4.0，乳清蛋白與阿拉伯膠質(zhì)量比為2:1，蝦青素添加濃度為60 μmol/L。

圖4 不同蝦青素濃度對(duì)蝦青素包封率的影響Fig.4 Effect of different astaxanthin concentrations on the encapsulation rate of astaxanthin

2.2 雨生紅球藻蝦青素納米顆粒的性質(zhì)研究

2.2.1 雨生紅球藻蝦青素納米顆粒的性質(zhì) 在2.1的最佳條件下制備的蝦青素納米顆粒，粒徑為265.71±0.55 nm，電位為-13.44±0.14 mV，包封率高達(dá)92.93%±0.19%。如圖5 所示，蝦青素在水中的溶解性得到明顯改善。

圖5 蝦青素納米顆粒在水中的溶解Fig.5 Dissolution of astaxanthin nanoparticles in water

2.2.2 傅里葉紅外光譜分析 蝦青素的FTIR 透射光譜及其特征峰與先前文獻(xiàn)的報(bào)道基本一致[35]。由圖6 可知，蝦青素有以下特征峰[34,36]：O-H 伸縮振動(dòng)吸收峰（3434 cm-1）、-CH3伸縮振動(dòng)峰（2922 cm-1）、C=O 伸縮振動(dòng)峰（1648 cm-1）、C=C 伸縮振動(dòng)峰（1551 cm-1）和C-H 疏水性伸縮振動(dòng)峰（976 cm-1）。蝦青素與壁材混合制備蝦青素納米顆粒后，蝦青素在976 cm-1處的吸收峰沒有顯現(xiàn)出來，而在3434、2922、1648 和1551 cm-1處的吸收峰發(fā)生了轉(zhuǎn)移，表明蝦青素在被包埋后O-H、-CH3、C=O 和C=C 的伸縮振動(dòng)受到了限制，蝦青素與壁材之間通過氫鍵和疏水作用相互結(jié)合，并有效包封在此基質(zhì)中。樊永康[36]在研究糖基化酪蛋白包封槲皮素時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

圖6 蝦青素（a）、壁材（b）和蝦青素納米顆粒（c）的FTIR 光譜圖Fig.6 FTIR spectrum of astaxanthin (a),wall material (b) and astaxanthin nanoparticles (c)

2.2.3 蝦青素納米顆粒的貯藏穩(wěn)定性 如圖7A 所示，新鮮制備的蝦青素納米顆粒的粒徑為265.71±0.55 nm，在貯藏15 d 內(nèi)，體系的平均粒徑隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。15 d 時(shí)，4、25 和37 ℃條件下貯藏的納米顆粒粒徑分別為：283.82±0.51、291.68±0.78和301.14±0.69 nm，差異顯著（P＜0.05）。體系粒徑在37 ℃貯藏條件下增幅最大，為13.1%，這可能是因?yàn)檩^高溫度下顆粒碰撞幾率增大而導(dǎo)致的體系平均粒徑增加。在4 ℃條件下，蝦青素納米顆粒表現(xiàn)出更好的貯藏穩(wěn)定性，粒徑增幅僅為6.1%。Hou 等[37]的研究也證實(shí)了乳清蛋白基人參皂苷Rg3 納米乳液在貯藏期間內(nèi)粒徑變大，以4 ℃貯藏溫度增幅最小。

圖7 蝦青素納米顆粒貯藏期間的粒徑（A）、Zeta 電位（B）、蝦青素保留率（C）和DPPH 自由基清除率（D）Fig.7 Particle size (A),Zeta potential (B),astaxanthin retention (C) and DPPH free radical clearance (D) of astaxanthin nanoparticles during storage

如圖7B 所示，新鮮制備的蝦青素納米顆粒的電位為-13.44±0.14 mV，在貯藏15 d 內(nèi)，體系的電位絕對(duì)值隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，表明貯藏期間內(nèi)體系靜電荷減少，這可能是由于阿拉伯膠少量脫落導(dǎo)致的[30]。如圖7C 所示，蝦青素保留率隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，但在15 d 內(nèi)，4、25 和37 ℃不同的溫度下，蝦青素保留率均在80%以上，表明壁材對(duì)蝦青素具有較好的包封作用，其中，以4 ℃的保留率最高，為90.78%±0.25%，這與Boonlao 等[29]在研究不同溫度下蝦青素乳液中蝦青素保留率的結(jié)果類似。由圖7D 可知，蝦青素納米顆粒的DPPH 自由基清除能力隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，這是由于貯藏期間內(nèi)蝦青素發(fā)生降解，保留率降低，進(jìn)而導(dǎo)致體系的抗氧化能力減弱，4、25 和37 ℃條件下貯藏15 d 時(shí)，體系的DPPH 自由基清除能力分別為79.31%±0.18%、74.82%±0.20%和69.34%±0.21%。綜上可見，在15 d的貯藏期內(nèi)，蝦青素納米顆粒能夠保持均勻分散，溫度越高引起的粒徑增幅越大，Zeta 電位的絕對(duì)值降低越快，進(jìn)而導(dǎo)致蝦青素保留率降低，體系的DPPH自由基清除能力降低。而4 ℃低溫貯藏對(duì)納米顆粒的粒徑、電位、蝦青素保留率及DPPH 自由基清除能力影響最小，能夠更好地保證蝦青素納米顆粒的穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用蝸牛酶水解提取雨生紅球藻蝦青素，并使用富含乳脂肪球膜的乳清蛋白粉與阿拉伯膠共同制備蝦青素納米顆粒，通過對(duì)pH、蛋白與阿拉伯膠質(zhì)量比以及蝦青素添加濃度的選擇，獲得穩(wěn)定性強(qiáng)的蝦青素納米顆粒，包封率高達(dá)92.93%±0.19%。經(jīng)傅里葉紅外光譜分析表明蝦青素與壁材之間通過氫鍵和疏水作用相互結(jié)合，且蝦青素有效地包封在壁材內(nèi)。在4 ℃條件下貯藏15 d，蝦青素保留率高達(dá)90.78%±0.25%。因此，基于富含乳脂肪球膜的乳清蛋白與阿拉伯膠制備的雨生紅球藻蝦青素納米顆粒有助于改善蝦青素的穩(wěn)定性，有助于蝦青素在水中溶解，并進(jìn)一步拓展蝦青素在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域中的應(yīng)用。