基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析尿嘧啶對出芽短梗霉產(chǎn)普魯蘭多糖的影響

陳世偉，唐淑賢，王舸楠，吳程遠，張淑慧，趙廷彬，殷海松，鄭志強，喬長晟,,5,6,

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津慧智百川生物工程有限公司，天津 300457；3.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津 300457；4.軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究所軍需工程技術(shù)研究所，北京 101300；5.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457；6.天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津 300457）

普魯蘭多糖又叫普魯蘭糖，短梗霉多糖或茁霉多糖，主要由出芽短梗霉所分泌的一種線性胞外多糖。普魯蘭多糖通過麥芽三糖重復(fù)單元經(jīng)α-1,6 糖苷鍵聚合而成，因此又被叫做聚麥芽三糖[1-2]。普魯蘭多糖是一種水溶性多糖，分子質(zhì)量在4.5×104～6×105Da[3]。普魯蘭多糖獨特的物理和化學(xué)性質(zhì)使其在食品、化妝品、制藥和生物醫(yī)藥行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。Mert 等[4]將普魯蘭多糖與丙烯酸-衣康酸共價制備成水凝膠用于傷口敷料。普魯蘭多糖能夠形成透明、耐油和不滲透氧氣的薄膜用于食品包裝[5]。作為淀粉的替代品用于加工食品和口腔護理產(chǎn)品中[6]。除了其優(yōu)良的風(fēng)味保持性能外，其在運輸和傳遞生物活性化合物方面的性質(zhì)使其成為生物醫(yī)學(xué)和制藥應(yīng)用的理想選擇材料[7]。普魯蘭多糖因其極高的商業(yè)價值在科研領(lǐng)域中始終保持著空前的熱度。因此，對普魯蘭多糖生物合成代謝機理的研究，以提高其產(chǎn)量具有重要的意義。

堿基和核苷是一類化合物，在編碼遺傳信息、信號傳遞和能量代謝等重要生理功能中起著重要作用[8]。尿嘧啶作為一種核苷酸類生長因子可以調(diào)控微生物的生長代謝活動。West 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加尿嘧啶可以增加農(nóng)桿菌的凝乳菌產(chǎn)量。Lee 等[10]在培養(yǎng)基中添加尿嘧啶可提高猴頭菌胞外多糖的產(chǎn)生。Saleh 等[11]研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加尿嘧啶，可促進魚類的生長。Sheng 等[12]研究了尿嘧啶對普魯蘭產(chǎn)量、生物量和尿苷磷酸化酶（UPase）活性的影響。但是關(guān)于尿嘧啶對出芽短梗霉產(chǎn)普魯蘭多糖代謝機理的研究，目前尚未報道。

本文通過對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，在培養(yǎng)基中添加生長因子尿嘧啶，研究其對普魯蘭多糖產(chǎn)量的影響。并通過Label-free 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對添加尿嘧啶對普魯蘭多糖發(fā)酵后期（88 h）的出芽短梗霉胞內(nèi)蛋白質(zhì)的差異進行了生物學(xué)分析，為了解尿嘧啶對出芽短梗霉合成普魯蘭多糖的代謝機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：CGMCCNO.7055；蔗糖 廣西田東縣制糖有限公司；酵母浸粉 維科特化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；硫酸銨、硫酸亞鐵 天津博迪化工股份有限公司；磷酸氫二鉀 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；硫酸鎂淄博川北化工有限公司；氯化鈉 維科特化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；所有試劑 均為國產(chǎn)分析純；種子培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖100，酵母浸粉3，（NH4）2SO41，K2HPO42，MgSO40.4，NaCl 2.5，F(xiàn)eSO40.05，用6.0 mol/L HCl 及6.0 mol/L NaOH 溶液 調(diào)節(jié)pH 至6.0，然后于121 ℃下滅菌20 min；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖150，蛋白胨5，MgSO40.4，NaCl 3，K2HPO47，F(xiàn)eSO40.05，用6.0 mol/L HCl 及6.0 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至6.0，然后于121 ℃下滅菌20 min。其中實驗組為在發(fā)酵48 h 時向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5 g/L的尿嘧啶。

SBA-40E 生物傳感器 山東省科學(xué)院生物研究所；5 L 自動發(fā)酵罐08-F25 型 鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司；TDL-5-A 型高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；5977B-7890B 氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀 德國安捷倫科技有限公司；LC-20A 高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 將4 ℃冰箱中保存待用的斜面取出，放在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行活化，時間為2～3 h。然后從活化好的斜面中挑一環(huán)孢子快速接到種子培養(yǎng)基中，最后放置在搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為180 r/min，28 ℃，培養(yǎng)時間為28～32 h。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 搖床發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液，以3%（v/v）的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，本文采用兩階段控溫培養(yǎng)，發(fā)酵前24 h 為32 ℃，發(fā)酵后64 h 溫度調(diào)為28 ℃，轉(zhuǎn)速為400 r/min，培養(yǎng)周期為88 h。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：裝液量為3 L，接種量為3%（v/v）即900 mL 種子液，初始pH 調(diào)至6.0，通風(fēng)比為1:1.25 vvm，罐壓為0.02 MPa，轉(zhuǎn)速為400 r/min，本文采用兩階段控溫培養(yǎng)，發(fā)酵前24 h 為32 ℃，發(fā)酵后64 h 溫度調(diào)為28 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)周期為88 h。

尿嘧啶最適添加量的優(yōu)化方法：初始添加量分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L，按照搖床發(fā)酵培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。

尿嘧啶最適添加時間的優(yōu)化方法：空白組為不添加尿嘧啶，實驗組添加時間分別為0、24、48、72 h，按照搖床發(fā)酵培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。

1.2.3 分析方法 殘?zhí)堑臏y定：參照文獻[13]試驗方法，將發(fā)酵液離心，取上清液1 mL 稀釋100 倍定容，用生物傳感器測定含量。

產(chǎn)量的測定：參照文獻[14]試驗方法，取上述上清液30 mL 加入60 mL 無水乙醇，攪拌均勻放置1 h 后抽濾，所得多糖放在60 ℃烘箱中烘干至恒重并稱重，按照式（1）計算得出普魯蘭多糖的產(chǎn)量。

式中：m 表示普魯蘭多糖產(chǎn)量，g/L；m1表示干燥濾紙的重量，g；m2表示普魯蘭多糖與干燥濾紙的總量，g。

菌體量的測定：將5 mL 發(fā)酵液于10 mL 離心管中離心，去上清置于60 ℃烘箱中，烘干至恒重稱重，按照式（2）計算得出菌體量。

式中：m 表示出芽短梗霉菌體量，g/L；m1表示離心管干重，g；m2表示出芽短梗霉菌體量與離心管總重，g。

1.2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)實驗方法

1.2.4.1 樣品的制備與提取 取適量培養(yǎng)至88 h 的發(fā)酵液于5 mL 離心管中，于4 ℃，5000 ×g 下冷凍離心15 min，將上清液去除掉留菌體，使用PBS 溶液對菌體進行洗滌，重復(fù)三次，最后將菌體用液氮進行速凍，保存至-80 ℃下備用。本文采用SDT 裂解法[15]。向樣品中加入一定量的SDT 裂解液進行超聲，超聲條件設(shè)置為：80 W，工作10 s 間歇15 s 重復(fù)此過程10 次，之后進行沸水浴，時間為15 min。然后將樣品于14000 ×g 下離心40 min 取上清。本文對蛋白質(zhì)進行定量使用的是BCA 法。最后樣品分裝好后，于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 酶解脫鹽及質(zhì)譜分析 參照Zhou 等[16]的方法。酶解后使用C18 Cartridge 對肽段進行脫鹽，然后將肽段凍干后加40 μL 0.1%的甲酸溶液進行復(fù)溶，肽段定量。質(zhì)譜分析使用納升流速的HPLC 液相系統(tǒng)Easy nLC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)為3 組平行樣品計算結(jié)果的平均值。Origin 2020 軟件作圖。GO 和KEGG 的注釋用Uniprot的Yeast 注釋數(shù)據(jù)完成。使用MaxQuant 軟件（版本號1.5.3.17）[17]對質(zhì)譜分析出來的原始數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫進行比對鑒定，然后進行定量分析。相關(guān)的數(shù)據(jù)參數(shù)和說明如表1 所示。

表1 搜庫參數(shù)Table 1 Parameters of searching

2 結(jié)果與分析

2.1 尿嘧啶對普魯蘭發(fā)酵的影響

2.1.1 尿嘧啶最佳添加量 在搖瓶發(fā)酵條件下，不同的尿嘧啶添加量對出芽短梗霉細胞生長和普魯蘭合成的影響結(jié)果如圖1 所示。添加不同濃度的尿嘧啶，對普魯蘭多糖的產(chǎn)量和菌體量均有一定的促進作用。特別是，添加0.5 g/L 的尿嘧啶對普魯蘭多糖的產(chǎn)量提高最高，由66.13 g/L 提高到73.47 g/L，相比對照提高了11%，同時，菌體量從11.68 g/L 提升到12.89 g/L，相比空白組提高10%。這可能是因為尿嘧啶的加入，影響了普魯蘭合成途徑中某些關(guān)鍵酶的活性，刺激了糖酵解等代謝途徑，有利于合成普魯蘭和菌體的生長。結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中尿嘧啶的存在有利于普魯蘭多糖產(chǎn)量的提高，這與Sheng 等[12]的研究結(jié)果一致，且其濃度為0.5 g/L 時，有最大的促進作用。

圖1 不同濃度梯度尿嘧啶對普魯蘭發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of different concentration gradients of uracil on the fermentation of pululan

2.1.2 尿嘧啶最佳添加時間 圖2 顯示了不同時間添加尿嘧啶對普魯蘭發(fā)酵的影響。由圖2 分析可知，尿嘧啶在不同時間添加對普魯蘭多糖的產(chǎn)量具有明顯的差異。從圖2 中可以看出，在48 h 添加0.5 g/L 的尿嘧啶對普魯蘭多糖的產(chǎn)量提高最高，由65.6 g/L 提高到79.5 g/L，相比對照提高了21%。尿嘧啶的添加時間為48 h 對普魯蘭多糖的產(chǎn)量有最大的促進作用。這可能是因為添加尿嘧啶后為出芽短梗霉合成普魯蘭多糖提供了更多的UDPG 前體物。在出芽短梗霉生長的中后期階段可以大量合成普魯蘭多糖這一次級代謝產(chǎn)物，然而在中后期階段UDPG 的含量最少，此時添加尿嘧啶為出芽短梗霉合成普魯蘭多糖提供了更多的前體物質(zhì)。

圖2 不同時間添加尿嘧啶對普魯蘭發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of uracil addition at different time on pullulan fermentation

2.1.3 尿嘧啶對普魯蘭多糖合成影響的發(fā)酵動力學(xué)上述實驗得出在發(fā)酵48 h 時添加0.5 g/L 的尿嘧啶對出芽短梗霉合成普魯蘭多糖的效果最佳，從發(fā)酵動力學(xué)方面來研究尿嘧啶對合成普魯蘭多糖的影響。根據(jù)圖3 可以看出，在發(fā)酵前48 h 內(nèi)，空白組與實驗組的菌體量、產(chǎn)量等指標(biāo)并無明顯變化。在48 h加入尿嘧啶后，實驗組普魯蘭多糖產(chǎn)量為86.27 g/L，較空白組的70.13 g/L 提高了23%，然而，實驗組的菌體量小于對照組，這表明普魯蘭多糖的產(chǎn)量與出芽短梗霉菌體量并無直接關(guān)系，這與Sheng 等[12]的研究結(jié)果一致。為了解尿嘧啶對出芽短梗霉產(chǎn)普魯蘭多糖內(nèi)在機理的影響，下面從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度進行分析。

圖3 尿嘧啶對普魯蘭多糖發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of uracil on the fermentation of pullulan polysaccharide

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.2.1 差異表達蛋白質(zhì)的定量及統(tǒng)計分析結(jié)果 以變化倍數(shù)大于2.0 倍（上調(diào)大于2 倍或者下調(diào)小于0.5）且Pvalue 小于0.05 的篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達蛋白質(zhì)，實驗組與空白組的差異表達蛋白質(zhì)數(shù)目如表所示。

由表2 可以看出，空白組和實驗組中共篩選出80 個差異蛋白，其中上調(diào)蛋白有40 個，下調(diào)蛋白有40 個。

表2 差異蛋白結(jié)果統(tǒng)計Table 2 Differential protein results statistics

2.2.2 差異表達蛋白質(zhì)的聚類分析結(jié)果 采用層次聚類算法（Hierarchical Cluster）對差異性表達蛋白進行聚類分析，數(shù)據(jù)用圖4 表示。紅色代表顯著性上調(diào)蛋白，藍色代表顯著性下調(diào)蛋白，顏色越深差異越明顯。在閾值條件下選擇倍數(shù)變化大于2 的差異蛋白進行分析。參與主要代謝途徑的部分差異蛋白如表3 所示，其中表達量上調(diào)的蛋白質(zhì)包括己糖激酶、6-磷酸果糖激酶-2 和異檸檬酸裂解酶，表達量下調(diào)的蛋白質(zhì)包括蘋果酸酶。

表3 差異蛋白結(jié)果統(tǒng)計Table 3 Differential proteins statistics

圖4 空白組和實驗組差異蛋白質(zhì)聚類分析Fig.4 Differential protein cluster analysis of blank and experimental groups

2.2.3 差異表達蛋白質(zhì)的基本本體功能富集分析結(jié)果 基因本體（Gene Ontology，簡稱GO）作為生物信息領(lǐng)域中一個極為重要的方法和工具，能夠從更加概括或者系統(tǒng)的方面對研究的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的功能進行更加深入的分析。GO 分析分為三個方面，分別為生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和細胞組分（Cellular Component，CC）。通過對實驗組和空白組差異蛋白的GO 功能富集分析，得到的結(jié)果如圖5 所示。

由圖5 可以看出，差異蛋白質(zhì)參與了磷脂生物合成過程、甘油磷脂生物合成過程、甘油脂生物合成過程等重要生物學(xué)過程。差異蛋白質(zhì)在分子功能上的體現(xiàn)在磷脂酰絲氨酸脫羧酶活性、碳-碳裂解酶活性、羧基裂解酶活性、含氧酸裂解酶活性、碳水化合物激酶活性。同時，在紡錘體、微管組織中心、細胞內(nèi)囊泡等定位蛋白質(zhì)，發(fā)生了顯著變化。

圖5 差異蛋白GO 功能富集分析（Top 20）Fig.5 GO functional enrichment analysis of differential proteins (Top 20)

2.2.4 差異表達蛋白質(zhì)的代謝通路分析結(jié)果 通過對本文所鑒定到的差異性蛋白進行KEGG 功能注釋分析，所得到的統(tǒng)計結(jié)果如圖6 所示。

通過對鑒定出來的差異蛋白進行KEGG 功能注釋，將其按照所屬的不同代謝途徑進行功能分類。并對不同途徑中富集到的蛋白數(shù)目進行統(tǒng)計，按照蛋白統(tǒng)計數(shù)目排列出前20 的代謝通路，統(tǒng)計注釋結(jié)果如圖6 所示。本文所研究的差異蛋白主要涉及的KEGG 途徑包括：核糖體、甘油磷脂代謝、氧化磷酸化、RNA 轉(zhuǎn)運、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、糖酵解、嘧啶代謝、果糖和甘露糖代謝和丙酸代謝。由此可見，上述代謝途徑均可能與普魯蘭多糖產(chǎn)量的變化有關(guān)。

圖6 差異蛋白KEGG 通路注釋Fig.6 Differential protein KEGG pathway annotations

2.2.5 差異表達蛋白質(zhì)的代謝途徑分析結(jié)果 隨著質(zhì)譜技術(shù)的革新，極大增強了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)測量的精度和可靠性[18]。蛋白質(zhì)組學(xué)方法也是揭示細胞和生物體在系統(tǒng)水平上的生物學(xué)功能、代謝網(wǎng)絡(luò)和功能性蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的有效工具[19]。以此，根據(jù)篩選出的差異蛋白質(zhì)，結(jié)合代謝通路分析結(jié)果，繪制了尿嘧啶引起的差異蛋白對出芽短梗霉代謝途徑的影響圖，如圖7 所示。

圖7 尿嘧啶引起的差異蛋白對出芽短梗霉代謝途徑的影響Fig.7 Effect of differential protein induced by uracil on metabolic pathway of Aureobasidium pullulans

由表3 可以看出表達量上調(diào)的蛋白質(zhì)包括己糖激酶、6-磷酸果糖激酶-2 和異檸檬酸裂解酶，表達量下調(diào)的蛋白質(zhì)包括蘋果酸酶。這些蛋白涉及到出芽短梗霉細胞胞內(nèi)的糖酵解、果糖和甘露糖代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、丙酮酸代謝和TCA 循環(huán)等代謝途徑。

己糖激酶被定義為磷酸化葡萄糖和其他緊密相關(guān)的己糖（甘糖、2-脫氧葡萄糖、葡萄糖胺和果糖）的第六碳上的酶，是參與磷酸化己糖的關(guān)鍵酶[20]。在糖酵解、果糖和甘露糖代謝途徑中己糖激酶可以催化D-葡萄糖形成D-6 磷酸葡萄糖、D-甘露糖形成D-6 磷酸甘露糖。D-6-磷酸葡萄糖可以轉(zhuǎn)化為D-1-磷酸葡萄糖，D-1-磷酸葡萄糖再轉(zhuǎn)化為UDPG，其為普魯蘭糖合成的前體物質(zhì)[21]。而D-6 磷酸甘露糖可以進一步異構(gòu)化形成β-D-6 磷酸果糖，后者進入糖酵解反應(yīng)中。因此，己糖激酶的表達量上調(diào)，一方面導(dǎo)致了UDPG 水平上漲，另一方面促進了糖酵解反應(yīng)的進行，從而提高普魯蘭多糖合成。

6-磷酸果糖激酶-2 在糖酵解代謝中可以催化D-6 磷酸果糖形成2,6-二磷酸果糖。而2,6-二磷酸果糖是6-磷酸果糖激酶-1 的最強激活劑同時也是糖異生途徑1,6-二磷酸果糖酶的抑制劑，其也是丙酮酸激酶的激活劑。6-磷酸果糖激酶-1 作為糖酵解途徑中的限速酶，因為2,6-二磷酸果糖的增多可以降低ATP、檸檬酸對其的抑制作用，從而促使6-磷酸果糖激酶-1 的活性增強。因此，6-磷酸果糖激酶-2 的表達量上調(diào)，使6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶的活性增強，1,6-二磷酸果糖酶的活性下降，這種三重調(diào)節(jié)作用的結(jié)合，解除了糖酵解反應(yīng)的速率限制，從而提高糖原的利用效率。

異檸檬酸裂解酶在醛酸和二羧酸代謝過程中可以促進異檸檬酸分解成琥珀酸。琥珀酸在TCA 循環(huán)中是一種必不可少的物質(zhì)，而琥珀酸含量的增加有利于TCA 循環(huán)的進行。TCA 循環(huán)是在線粒體中運行的一種雙向通路，在大多數(shù)真核生物中已成為一個中心代謝中樞，是能量代謝的中心過程[22]。因此異檸檬酸裂解酶的表達量上調(diào)使TCA 循環(huán)更加高效的進行。

蘋果酸酶在丙酮酸代謝過程中是催化蘋果酸生成丙酮酸的關(guān)鍵酶，蘋果酸酶的表達量下調(diào)，從而抑制了蘋果酸生成丙酮酸。Xue 等[23]研究了過表達蘋果酸-丙酮酸途徑可促進脂肪酸的生物合成。而蘋果酸酶的表達量下降，積累的蘋果酸有助于TCA 循環(huán)的進行，從而為出芽短梗霉菌體的生長和普魯蘭多糖的合成提供了更多的能量。

3 結(jié)論

通過Label-free 技術(shù)研究了添加尿嘧啶對出芽短梗霉合成普魯蘭多糖過程中胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化，結(jié)果表明共篩選出80 個差異性蛋白質(zhì)，其中包括40個上調(diào)蛋白和40 個下調(diào)蛋白。GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)兩組間的差異蛋白主要參與磷脂生物合成過程、甘油磷脂生物合成過程以及蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運過程等。通過對本文所鑒定到的差異蛋白進行KEGG 功能注釋分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要涉及的KEGG 途徑包括氧化磷酸化、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、糖酵解、果糖和甘露糖代謝和丙酸代謝等代謝途徑。結(jié)合出芽短梗霉合成普魯蘭多糖的代謝途徑分析兩組間的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)己糖激酶的表達量上調(diào)，增強了糖酵解和果糖和甘露糖相關(guān)代謝途徑，為出芽短梗霉合成普魯蘭多糖提供了更多的UDPG 前體物質(zhì)；6-磷酸果糖激酶-2 表達量上調(diào)，促進了糖酵解反應(yīng)的高效進行；異檸檬酸裂解酶的表達量上調(diào)促進了乙醛酸和二羧酸代謝，蘋果酸酶的下調(diào)抑制了丙酮酸代謝，這兩個途徑可間接增強TCA 循環(huán)，從而為出芽短梗霉菌體的生長和普魯蘭多糖的合成提供了更多的能量。研究結(jié)果有助于理解尿嘧啶在普魯蘭生物合成中的作用機制，為進一步提高普魯蘭的產(chǎn)量提供了新途徑。