漁用誘食劑DMPT和DMT的檢測(cè)方法研究

◆作者：林茂發(fā)

◆單位：福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院 國(guó)家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心（福州）

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，已經(jīng)成為我國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要支柱，根據(jù)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《“十四五”全國(guó)漁業(yè)發(fā)展規(guī)劃》，到2025 年水產(chǎn)品總量要達(dá)到6900 萬(wàn)噸，國(guó)內(nèi)海洋捕撈產(chǎn)量控制在1000 萬(wàn)噸以內(nèi)，要建成一批國(guó)家級(jí)水產(chǎn)健康養(yǎng)殖和生態(tài)養(yǎng)殖示范區(qū)。要實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康、綠色低碳環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展，除了優(yōu)質(zhì)的種苗外，作為養(yǎng)殖業(yè)主要成本組成的飼料已成為養(yǎng)殖場(chǎng)考慮的因素。

優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)飼料特點(diǎn)為：適口性好，所喂養(yǎng)的魚(yú)類健康，成長(zhǎng)快，餌料系數(shù)低，對(duì)水質(zhì)污染小，養(yǎng)殖戶能節(jié)約成本。然而近年來(lái)由于國(guó)外捕撈限制等原因，進(jìn)口魚(yú)粉的價(jià)格一直在高位運(yùn)行，使得水產(chǎn)配合飼料尤其是特種水產(chǎn)飼料成本大幅提升，飼料企業(yè)考慮成本因素，盡量減少魚(yú)粉的使用量或者采用魚(yú)粉的替代原料來(lái)生產(chǎn)配合飼料（易皓明等，2021）。導(dǎo)致配合水產(chǎn)飼料的適口性下降，魚(yú)類攝食時(shí)間變長(zhǎng)，飼料散失，降低了餌料效率，因此如何改善水產(chǎn)飼料的適口性，是飼料企業(yè)和養(yǎng)殖戶所要解決的問(wèn)題之一，實(shí)踐證明，添加誘食劑是改變水產(chǎn)配合飼料適口性的有效方法（許國(guó)煥等，2000）。目前水產(chǎn)配合飼料所采用的誘食劑種類繁多，主要有合成化合物和各類動(dòng)植物原料及其提取物。含硫化合物是水產(chǎn)誘食劑的重要組成部分，包括二甲基-β-乙酸噻亭（Sulfobetaine，DMT）、二甲基-β- 丙酸噻亭（Dimethylbeta-propiothetin，DMPT） 和大蒜素等。其中DMPT 作為新型的水產(chǎn)誘食劑具有極強(qiáng)的誘食能力，有實(shí)驗(yàn)表明在餌料中含量為10-3mol/L 時(shí)就能起到很好的誘食效果（中島謙二等，1989）。由于具有甲基硫（（CH3）2S-）官能團(tuán)因此能夠起到甲基供體促進(jìn)生長(zhǎng)的作用以及大蒜素的部分消炎殺菌功能，同時(shí)能夠保肝利膽增強(qiáng)魚(yú)類抗應(yīng)激能力，具備某些維生素功能如促進(jìn)脫殼等（薛飛等，2007；趙紅霞等2006；馬江耀，2008）。DMPT 是海產(chǎn)品風(fēng)味的主要特征成分，添加DMPT 喂養(yǎng)的淡水魚(yú)類產(chǎn)品肉質(zhì)具有海水魚(yú)類肉質(zhì)風(fēng)味，能產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益。

市場(chǎng)上常見(jiàn)銷售的含硫化合物水產(chǎn)誘食劑有 DMT、DMPT，其中DMPT 主要以鹽酸鹽的形式存在，兩者外觀相似。DMT 雖然具有DMPT 的一些類似功能，但使用效果明顯不如DMPT，因此如何準(zhǔn)確對(duì)這兩種產(chǎn)品定性定量，引起飼料企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)的關(guān)注，目前對(duì)這兩種產(chǎn)品的檢測(cè)方法的公開(kāi)報(bào)導(dǎo)文獻(xiàn)較少。本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)出高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)漁用誘食劑DMT 和DMPT（分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1），該方法簡(jiǎn)單快速，準(zhǔn)確可靠，能為企業(yè)的質(zhì)量管理和市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)支持。

圖1 DMPT 和DMT 的分子結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器:氣相色譜儀帶自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)聯(lián)FID 檢測(cè)器及配套工作站（日本SHIMADZU 公司），石英毛細(xì)管柱 (ZB-WAX,30m×0.32mm×0.25μm) 美國(guó) Agilent公司,QP-2020NX 氣質(zhì)聯(lián)用儀，配備 EI 源（日本 SHIMADZU 公司）;高效液相色譜儀配光電二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters 公司，Waters 2695）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，BSA224S）；高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-800KDE）；分析天平（賽多利斯北京有限公司）；MilliQ超純水制備器（美國(guó)密理博有限公司）。乙腈（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司），其它試劑均為分析純。標(biāo)準(zhǔn)品：DMPT（純度99.9%）、DMT（純度 99.9%）均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.2 溶液配制

磷酸二氫鉀溶液：稱取10.207g 磷酸二氫鉀于燒杯，用50mL 水溶解后，轉(zhuǎn)移到1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱取 DMT、DMPT 各 0.5005g 用蒸餾水溶解并定容至50mL 配得儲(chǔ)備液的濃度均為10mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：將DMT和DMPT 的儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋為濃 度 為 0.1、0.5、1、2.5、5mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。所有標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液置于冰箱中于0～4℃溫度下保存。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取飼料添加劑樣品0.1g(精確至 0.0001g)到 50mL 具塞比色管中，用10mL蒸餾水溶解后，置于超聲波振蕩器中在冰水浴條件下超聲萃取15min 后，定容并搖勻，用水相濾膜過(guò)濾，濾液供上機(jī)分析用。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Welch ultimate HILIC-C 18 柱（4.6mm×250mm，5μm），月旭科技（上海）股份有限公司。柱溫：35℃。流動(dòng)相：乙腈（A）- 水（B）=60/40(V/V)等度洗脫；流速：1.0mL/min；洗脫時(shí)間：15min；進(jìn)樣量 5μL；檢測(cè)波長(zhǎng)192nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)方法的選擇

由于 DMT 和 MDPT 這兩種水產(chǎn)誘食劑的檢測(cè)文獻(xiàn)較少，因此本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)采用氣相色譜法和液相色譜法的可行性進(jìn)行探討。首先考察氣相色譜法的可行性, 氣相色譜儀器條件為：ZB-WAX 石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm× 0.25μm），進(jìn)樣口溫度為200℃，柱溫為180℃恒溫加熱15min，檢測(cè)器溫度為230℃，得到氣相色譜圖見(jiàn)圖2、圖3，由于兩種單標(biāo)氣相色譜圖都出現(xiàn)兩個(gè)較大的峰，考慮到目標(biāo)化合物可能發(fā)生分解，采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)一步確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)DMT 在氣相色譜條件下分解的主要產(chǎn)物為2- 甲基硫乙酸甲酯和2- 甲基硫乙酸，DMPT 分解的主要產(chǎn)物為丙烯酸和3- 甲基硫丙酸，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4、圖5，由此判斷這兩種目標(biāo)化合物受熱易分解，不能采用氣相色譜法檢測(cè)，故本實(shí)驗(yàn)選擇高效液相色譜法。

圖2 DMT 氣相色譜圖

圖3 DMPT 氣相色譜圖

圖4 DMT 分解產(chǎn)物總離子流圖和質(zhì)譜圖

圖5 DMPT 分解產(chǎn)物的總離子流圖和質(zhì)譜圖

2.2 液相色譜條件的選擇和優(yōu)化

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

為了考察檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)目標(biāo)化合物檢測(cè)靈敏度的影響，使用光電二極管陣列檢測(cè)器在190～800nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì) DMPT 和DMT 兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，得到DMPT 和DMT 的紫外—可見(jiàn)光譜圖（見(jiàn)圖6）。發(fā)現(xiàn)DMPT和DMT 均在波長(zhǎng)為192nm 處具有最強(qiáng)的響應(yīng)，根據(jù)其光譜圖并結(jié)合這兩種化合物的響應(yīng)靈敏度，最終選擇192nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖6 DMPT 和DMT 的紫外—可見(jiàn)光譜掃描圖

2.2.2 色譜柱和流動(dòng)相的選擇

考慮到DMPT 和 DMT 這兩種化合物屬于锍鹽類，本文比較了菲羅門(mén)Madex SCX 離子交換柱（4.6mm×250 mm，5μm）和Welch ultimate HILIC-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）親水柱這 2種色譜柱以及不同流動(dòng)相體系對(duì)DMPT 和DMT 的分離效果進(jìn)行比較（見(jiàn)圖7）。結(jié)果表明，采用Madex SCX 離子柱，流動(dòng)相體系為0.075mol/L 磷酸二氫鉀溶液/乙腈=85/15（V/V）進(jìn)行等度洗脫時(shí)，目標(biāo)物色譜峰響應(yīng)值較低，出峰時(shí)間靠前，尤其DMPT 的色譜峰拖尾嚴(yán)重，且DMT 和DMPT分離度較差，影響定量結(jié)果準(zhǔn)確性（見(jiàn)圖7A），而采用Welch ultimate HILIC-C18 親水柱，流動(dòng)相體系為乙腈/水 =60/40（V/V）進(jìn)行等度洗脫時(shí)，DMT 和 DMPT 的色譜峰響應(yīng)都較強(qiáng)，峰形尖銳，出峰時(shí)間適宜且分離效果好（見(jiàn)圖7B），因此本實(shí)驗(yàn)選用Welch ultimate HILIC-C18 （4.6mm ×250mm，5μm）親水柱作為分析柱，以乙腈/水=60/40（V/V）進(jìn)行等度洗脫檢測(cè)。

圖7 不同流動(dòng)相對(duì)DMPT 和DMT 的分離效果

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性方程、線性關(guān)系、檢出限及定量限

配制 DMT 和 DMPT 濃度為0.10~5.0mg/mL 之間的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.4 色譜條件進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)X，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)Y，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù),根據(jù)10 倍信噪比計(jì)算方法的定量限。見(jiàn)表1。

表1 DMT 和DMPT 的線性回歸方程及方法定量限

2.3.2 方法回收率和精密度

取空白基質(zhì)米糠樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)試，加標(biāo)水平分別為 100、500、800g/kg，每個(gè)水平重復(fù)分析6 次，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可知，該方法的加標(biāo)回收率范圍為95.5%～102.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD范圍為0.89%～2.00%。

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n =6)

2.3.3 方法穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按上述的前處理方法制備樣品溶液濃度為5mg/mL，按前述方法測(cè)定 DMT 和 DMPT 含量，樣品溶液密封保存在室溫環(huán)境中，隔 8、16、24、48 和 72 h 測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明樣品溶液在72h 內(nèi)穩(wěn)定。

表3 樣品溶液穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

3 實(shí)際樣品檢測(cè)

從市場(chǎng)購(gòu)得DMT 和DMPT的原料樣品（含量在95%以上），以及以DMT 和DMPT 為主要成分混合型誘食劑，采用本實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)，結(jié)果較理想。實(shí)際樣品譜圖見(jiàn)圖8。

圖8 實(shí)際樣品色譜圖

4 結(jié)論

本研究建立高效色譜法同時(shí)檢測(cè)漁用誘食劑中的DMT 和DMPT 的方法，本方法前處理簡(jiǎn)單易于操作，具有較寬的線性范圍且有顯著的線性關(guān)系，加標(biāo)回收率高，重現(xiàn)性好，使用儀器設(shè)備普及率高的特點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中同時(shí)考察了氣相色譜法檢測(cè)的可行性，研究發(fā)現(xiàn)DMT 和DMPT 具有受熱易分解的特點(diǎn)，能為生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)用這兩種誘食劑提供技術(shù)參考。