體外受精-胚胎移植出生子代性別比影響因素分析

倪運萍 洪銳芳 陸杉 陳旭龍 鄧雪梅 袁啟龍

1廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，廣州 510006；2廣東省生殖醫(yī)院，廣州 510006

輔助生育技術已經(jīng)發(fā)展40 余年，囊胚移植技術自1995 年起，臨床應用越來越廣泛。囊胚培養(yǎng)移植不僅與子宮內膜同步性更好，也是優(yōu)質胚胎的進一步篩選過程。研究表明，與卵裂期胚胎移植相比，單囊胚移植不僅能增加臨床妊娠率及活產(chǎn)率，還能降低雙胎及雙胎相關并發(fā)癥的發(fā)生率［1］。但囊胚培養(yǎng)可能會使部分患者面臨無可移植胚胎或無可冷凍胚胎的風險，同時越來越多的文獻證實囊胚移植會使男胎出生比例增高［2-3］。另一方面，自1992年比利時學者Palermo 等［4］報道采用卵胞漿內單精子顯微注射（ICSI）成功使不育患者獲得妊娠以來，其技術越來越成熟，中國輔助生殖界已將ICSI技術列為解決男性嚴重少、弱、畸及無精子癥患者生育的最佳選擇［5］，讓越來越多的男性嚴重精子異常不育患者獲得了生育子代的機會，但ICSI 技術被認為女胎出生比例增加［2］。而不同來源的精子形成的胚胎移植后子代出生性別比卻較少見有報道。

資料與方法

1、臨床資料

回顧性分析2013年6月至2021年6月在廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）治療分娩的胎兒性別數(shù)據(jù)，按卵裂期胚胎與囊胚期胚胎進行分組比較、按不同受精方式（IVF、ICSI）進行分組比較，ICSI 組按不同來源精子分為經(jīng)皮睪丸穿刺取精組、經(jīng)皮附睪穿刺取精組與射精取精組進行比較。

（1）納入標準：所有經(jīng)體外受精-胚胎移植治療后分娩可以通過第二性征辨別性別的移植周期數(shù)據(jù)。（2）排除標準：①按不同受精方式分組時排除IVF+ICSI 混合受精移植周期數(shù)據(jù)；②按不同期別分組時排除兩步移植法（卵裂期+囊胚期胚胎）混合移植周期數(shù)據(jù)；③剔除移植胚胎妊娠同時合并自然同房受孕移植周期數(shù)據(jù)；④行多因素logistic 回歸分析時剔除同一移植周期分娩不同性別胎兒移植周期數(shù)據(jù)。

2、促排卵方案

符合行體外受精-胚胎移植治療納入的不孕夫婦，女方進行促排卵治療，促排卵方案包括長方案、拮抗劑方案、微刺激方案、黃體期促排卵方案等。

3、取卵及受精

女方卵泡達到常規(guī)取卵標準后，晚上注射人絨毛膜促性腺激素（珠海麗珠）5 000～10 000 U 肌內注射，或重組人絨毛膜促性腺激素（默克雪蘭諾，瑞士）250 μg皮下注射；拮抗劑方案為預防卵巢過度刺激綜合征（OHSS）發(fā)生采用醋酸曲普瑞林（輝凌，瑞士）0.2 mg 扳機；35～38 h 后行經(jīng)陰道B 超引導下取卵。精子獲得均為手淫取精方式或穿刺取精獲取，采用上游法或直接洗滌法獲得精子，受精方式為IVF或ICSI。

ICSI 適應證：（1）嚴重的少、弱、畸精子癥（精子濃度<5×106/ml、PR<10%、正常形態(tài)率<2%），回收到的前向運動精子數(shù)量不足以進行IVF-ET 治療；（2）不可逆的梗阻性無精子癥；（3）生精功能障礙；（4）精子頂體功能異常；（5）既往IVF受精失敗史或者IVF低受精率史（受精率<30%）。

4、胚胎移植及黃體支持

新鮮周期移植患者取卵后第3 天進行卵裂期胚胎移植，或取卵后第5 天進行囊胚移植；凍融周期移植患者轉化內膜第4 天行卵裂期胚胎移植或第6 天行囊胚移植。取卵后當日或凍融周期轉化內膜日即開始給予黃體酮注射液（湖南康都）40 mg/d 肌內注射，或使用陰道黃體酮凝膠（默克雪蘭諾，瑞士）90 mg/d 陰道給藥，并加用地屈孕酮（雅培，美國）20 mg/d口服。

囊胚培養(yǎng)適應證：（1）35 歲以下，取卵數(shù)≥12～15 個，第3 天優(yōu)質胚胎≥5～8 個，可做胚胎優(yōu)化選擇者；（2）不明原因IVF 失敗史（超過3 次），卵裂期胚胎質量好而種植失敗者；（3）因其他原因需暫緩胚胎移植，但不愿放棄新鮮胚胎移植者；（4）胚胎質量達不到移植或冷凍標準，繼續(xù)囊胚培養(yǎng)，若有囊胚形成可再移植或冷凍。

穿刺取精適應證：（1）無精子癥患者；（2）射精障礙患者；（3）逆行射精患者；（4）取卵日取精失敗患者。

穿刺取精方法選擇：（1）經(jīng)皮附睪穿刺取精。適用于梗阻性無精子癥附睪擴張的患者；（2）經(jīng)皮睪丸穿刺取精：適用于附睪穿刺取精失敗患者，非梗阻性無精子患者。本研究均采用經(jīng)皮局部麻醉下穿刺取精方式取精。

5、觀察指標

女方年齡、獲卵數(shù)、移植優(yōu)質胚胎比例、出生性別比等。出生性別比（secondary sex ratio，SSR）：為每100 名女嬰對應的男嬰數(shù)，即出生性別比=男嬰出生數(shù)/同期女嬰出生數(shù)×100。優(yōu)質胚胎評選標準：（1）優(yōu)質卵裂期胚胎評選標準。D3 胚胎細胞數(shù)7～9 細胞，卵裂球大小均勻，碎片率≤10%；（2）優(yōu)質囊胚胚胎評選標準：D5～6 囊胚分期≥4 期，且其內細胞團（ICM）為A或B級定為優(yōu)質囊胚。

6、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，采用單因素 ANOVA 檢驗（方差齊）；計數(shù)資料采用χ2檢驗及Fisher’s 精切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用多因素logistic回歸分析法對多因素進行同時分析。

結 果

1 663 例患者共接受1 744 個新鮮及凍融移植周期獲得分娩，累計分娩胎兒2 146 個。總的男女出生性別比為116∶100（1 158∶998），移 植 優(yōu) 質 胚 胎 比 例 為67.63%（2 052/3 034）。1 例患者移植1 枚囊胚獲得妊娠同時合并自然同房妊娠（分娩龍鳳胎）予以剔除。7 例患者移植單個囊胚獲得單卵雙胎妊娠并雙胎分娩。

1、移植卵裂期胚胎與囊胚比較

1例患者移植卵裂期胚胎+囊胚分娩1胎予以剔除。卵裂期胚胎分娩胎兒占比為78.74%（1 689/2 145）。9 例患者在移植卵裂期胚胎分娩后再次移植囊胚獲得分娩，6例患者移植囊胚獲得分娩后再次移植卵裂期胚胎獲得分娩，43 例患者2次均移植卵裂期胚胎分娩，22例患者2次均移植囊胚獲得分娩，1 例患者移植卵裂期胚胎分娩后再次移植卵裂期+囊胚期胚胎獲得分娩。卵裂期胚胎移植1 310個周期與囊胚移植433 個周期比較：移植卵裂期胚胎女方年齡高于移植囊胚女方年齡，移植卵裂期胚胎組獲卵數(shù)、移植優(yōu)質胚胎比例、出生性別比等均顯著低于移植囊胚組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見表1。

表1 卵裂期與囊胚期胚胎移植臨床資料與結果比較

2、移植IVF胚胎與ICSI胚胎比較

5個IVF+ICSI周期移植IVF與ICSI混合胚胎，比較時予以剔除。IVF胚胎移植分娩胎兒占比為74.94%（1 603/2 139）。1 306個IVF 胚胎移植周期與433個ICSI胚胎移植周期獲得分娩，IVF胚胎移植周期組女方年齡及出生性別比均顯著高于ICSI 胚胎移植周期組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 不同受精方式胚胎移植臨床資料與結果比較

3、IVF移植卵裂期胚胎與囊胚比較

IVF 移植分娩周期中有954 個周期移植卵裂期胚胎獲得分娩，352個周期移植囊胚獲得分娩，兩組比較，移植卵裂期胚胎女方年齡高于移植囊胚組，移植卵裂期胚胎獲卵數(shù)、移植優(yōu)質胚胎比例、出生性別比等均顯著低于移植囊胚組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見表3。

表3 IVF移植卵裂期與囊胚期胚胎的臨床資料與結果比較

4、ICSI移植卵裂期胚胎與囊胚比較

ICSI 移植分娩周期中有351 個周期移植卵裂期胚胎獲得分娩，81個周期移植囊胚獲得分娩，卵裂期胚胎組女方年齡、出生性別比與囊胚組比較差異均無統(tǒng)計學意義；卵裂期獲卵數(shù)、移植優(yōu)質胚胎比例均顯著低于囊胚期，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。但ICSI移植囊胚期胚胎出生性別比略高于卵裂期胚胎。見表4。

表4 ICSI移植卵裂期與囊胚期胚胎的臨床資料與結果比較

5、不同來源精子行ICSI治療分娩子代性別比比較

共有55 例患者在移植穿刺取精來源精子后獲得分娩，出生性別比為90.2∶100（37∶41），其中22例來源于附睪穿刺取精，32例來源于睪丸穿刺取精，1例為經(jīng)皮睪丸穿刺聯(lián)合附睪穿刺獲得精子（分組比較時予以剔除），共58個移植周期獲得分娩（經(jīng)皮睪丸穿刺取精33 個周期，經(jīng)皮附睪穿刺取精24個周期，經(jīng)皮睪丸穿刺聯(lián)合經(jīng)皮附睪穿刺取精1個周期）。

行穿刺取精原因為：無精子癥45 例（其中22 例為經(jīng)皮附睪穿刺取精，22 例為經(jīng)皮睪丸穿刺取精，1 例為附睪穿刺聯(lián)合睪丸穿刺取精），射精障礙2 例，逆行射精2 例，取卵日出現(xiàn)取精困難3 例，取卵日精液里無精子3 例，射精障礙與取精困難患者均采用睪丸穿刺取精獲得精子進行受精。

ICSI組根據(jù)精子來源不同分為3組：經(jīng)皮睪丸穿刺取精組、經(jīng)皮附睪穿刺取精組、射精取精組，3 組獲卵數(shù)、移植優(yōu)質胚胎比例以及出生性別比差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。射精取精組女方年齡高于其他兩組（均P<0.05）。睪丸穿刺組子代出生性別比略高于附睪穿刺組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表5。

表5 不同來源精子行ICSI治療的臨床資料與結果比較

6、影響出生性別比的多因素logistic回歸分析

剔除同一移植周期分娩不同性別的移植周期數(shù)據(jù)。對1 540 個單性別出生的移植周期進行多因素logistic 回歸分析：移植胚胎期別為影響出生性別比的獨立危險因素（P<0.05），而受精方式、女方年齡（按不同年齡段進行分組：≤30歲，30～35歲，>35～40歲，≥40歲）及獲卵數(shù)（按不同獲卵數(shù)進行分組：1～5枚，6～10枚，11～15枚，≥16枚）并非獨立危險因素。見表6。

表6 影響出生性別比的多因素logistic回歸分析

討 論

一般認為，正常的出生人口性別比（即正常值域）應在102～107 之間，而中國的出生性別比長期出現(xiàn)偏高的趨勢［6］。隨著輔助生育技術在全球的廣泛開展，其SSR 也被密切關注，大樣本數(shù)據(jù)顯示經(jīng)ART 治療的出生性別比分 別 為 英 聯(lián) 邦［7］104.0∶100、新 西 蘭［8］105.3∶100、美國［9］103.7∶100、中 國［10］107∶100。我們 中 心的 SSR 為116∶100，數(shù)值上略高于全球報道的大數(shù)據(jù)。

目前報道與輔助生育技術SSR 相關的因素多圍繞移植胚胎期別及受精方式兩方面進行，普遍認為囊胚移植會在一定程度上增加男胎出生的概率，采用ICSI 受精卻會在一定程度上降低男胎出生的概率［7-11］。本文數(shù)據(jù)也顯示，移植囊胚SSR 顯著高于移植卵裂期胚胎SSR。關于囊胚移植男胎出生比例增高的原因，可能有以下幾種解釋：在正常人類發(fā)育過程中，存在性別偏見死亡的趨勢，即懷孕期間女性胎兒的總體死亡率更高，認為與繼發(fā)于母體遺傳的mRNA 或胚胎合成的RNA 表達中斷有關［12］、父源X 染色體影響了胚胎的正常發(fā)育［13］、囊胚培養(yǎng)可能更有利于男性胚胎的發(fā)育，因為早期男性胚胎比女性胚胎更易攝取丙酮酸和葡萄糖［14］。Bouillon 等［15］移植了第 5 天擴張率最高的胚胎，結果表明移植此類胚胎子代男性比例顯著增加。細胞數(shù)越多、細胞分裂速度越快的胚胎，其遺傳物質為男性的概率越高。因此，男性胚胎被選為優(yōu)質囊胚并進行移植的概率也就會增加［16-17］。Lou 等［18］研究顯示優(yōu)質囊胚移植后分娩男胎的可能性高于非優(yōu)質囊胚，與女性囊胚相比，男性囊胚發(fā)育速度更快，形態(tài)學評分也高于女性囊胚。還有研究顯示，囊胚移植除了增加出生性別比，也可能會增加單卵雙胎的風險［19-21］，本研究中囊胚移植單卵雙胎發(fā)生率為1.62%。另外有研究顯示種植前遺傳學診斷技術（pre-implantation genetic testing，PGT）因大多采用囊胚進行活檢，因此也可能存在著使出生性別比增加的潛在風險［22］，因筆者所在中心不具備PGT 資質，故目前尚不存在PGT 導致出生性別比偏倚的問題。數(shù)據(jù)提示囊胚分娩的患者移植優(yōu)質胚胎比例高達80%以上，且這部分患者女方整體年齡均較輕，獲卵數(shù)多，胚胎培養(yǎng)形成可利用囊胚比例高，凍存胚胎數(shù)較多，胚胎選擇空間大，單從發(fā)育速度及形態(tài)學上進行選擇，男胚被選的概率會明顯增加，美國ART 大數(shù)據(jù)分析顯示女方年齡小于35 歲患者分娩男胎比例最高，而隨著獲卵數(shù)及凍存胚胎數(shù)的增加，男胎比例也隨之增加［7］。但本研究數(shù)據(jù)經(jīng)多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，相對于獲卵數(shù)及女方年齡，只有移植不同期別胚胎才是影響SSR的獨立危險因素。

孫文楓等［23］報道移植IVF 胚胎的SSR 明顯高于移植ICSI 胚胎，這與本研究初步統(tǒng)計的數(shù)據(jù)相一致。關于ICSI受精分娩男胎比例下降的原因可能有以下幾種：ICSI 被認為可以克服生理受精過程中含Y 精子與卵母細胞結合能力降低的問題，因此有可能使卵母細胞與異常的Y 精子受精但卻無法發(fā)育形成可存活的胚胎，使得男性胚胎無法被優(yōu)先選擇［24］；還有研究表明，注射從細胞形態(tài)學選擇的精子到卵母細胞中獲得的XX 胚胎的發(fā)生率在統(tǒng)計學上顯著高于XY 胚胎，因此推測形態(tài)正常的精子可能更傾向于攜帶X 染色體［25］，在不育男性中，Y 染色體的改變可能導致形態(tài)學改變，從而阻止在高倍鏡下選擇Y 精子且更傾向與選擇攜帶X 染色體的精子，最終導致女性胚胎比例增加。但因為女性胚胎早期發(fā)育過程中死亡率高，導致最終的出生性別比可能高于植入時的男女胚胎性別比。還有研究發(fā)現(xiàn)即使行IVF治療，精子活力低的男性子代出生性別比會低于精子活力正常的男性［26］，考慮男性精子質量仍然是需要被關注的因素。本文回顧性分析病例中采用ICSI治療的病例絕大部分均為男方嚴重精子異常患者，總體出生性別比略低于全球大數(shù)據(jù)［7-10］，但與國內文獻報道數(shù)據(jù)基本相符，考慮可能與ICSI 適應證選擇的差異性有關。但經(jīng)多因素logisitic 回歸分析發(fā)現(xiàn)在剔除同一周期分娩不同性別胎兒的分娩周期時受精方式并不是影響SSR 的獨立危險因素，尚需要更大樣本量的數(shù)據(jù)進行證實。

本研究發(fā)現(xiàn)不同來源精子行ICSI治療子代出生性別比并差異無統(tǒng)計學意義，納入研究中穿刺取精來源精子出生性別比接近于文獻報道的 83.1∶100［27］及 94.5∶100［28］。但睪丸穿刺取精組出生性別比（105：100）略高于附睪穿刺取精組（74∶100），F(xiàn)edder 等［27］報道睪丸穿刺取精組出生性別比也略高于附睪穿刺組（88.2∶100 比67.9∶100），但差異無統(tǒng)計學意義。Zhu 等［29］也報道不同來源精子子代出生性別比差異無統(tǒng)計學意義。常規(guī)認為附睪穿刺來源精子成熟度優(yōu)于睪丸穿刺來源精子，睪丸穿刺來源精子在體外孵育的過程中有部分因質量欠佳可能無法發(fā)育至成熟階段而被淘汰，由此推測成熟速度快且相對優(yōu)質的精子被用于受精的可能性較大，這種情況是否會對實驗室以及臨床結局造成影響尚不得而知，是否會對出生性別比造成影響也不得而知，早期也有報道［30］附睪精子和睪丸精子受精率、卵裂率、臨床妊娠率、種植率和早期流產(chǎn)率并無差異性。這些均需要擴大樣本量、多中心數(shù)據(jù)合作進行深入研究。

在發(fā)現(xiàn)胚胎期別是影響SSR 的獨立危險因素的基礎上，本研究發(fā)現(xiàn)使用IVF 受精后移植囊胚SSR（153∶100）及ICSI 受精后移植囊胚SSR（126∶100）均高于移植卵裂期胚胎，且高于平均SSR，因此推測若將囊胚培養(yǎng)及移植的策略廣泛運用于臨床可能會加劇SSR 失衡。但本研究中移植囊胚出生的子代在分娩子代中所占的比例較低，因此尚未對出生性別比造成較大的影響。

考慮到樣本量的局限性，目前大部分患者在一次分娩后尚未產(chǎn)生二次分娩，因此尚不能排除多次胚胎移植分娩后可能會對出生性別比造成不一樣的影響，另外本研究進行分析的相關因素相對比較局限，后續(xù)需要增加樣本量，增加胚胎移植分娩次數(shù)以及增加相關影響因素等進行更深入的分析研究。

作者貢獻聲明倪運萍：撰寫和修改論文；洪銳芳：文獻查閱與翻譯；陸杉：研究設計及論文書寫指導；陳旭龍：數(shù)據(jù)采集整理；鄧雪梅：分娩隨訪；袁啟龍：統(tǒng)計學分析與經(jīng)濟支持