雙去甲氧基姜黃素對小鼠乳腺癌的抗腫瘤作用及機制

李學(xué)瑛 徐陽 王秘

1 濱州職業(yè)學(xué)院健康學(xué)院，濱州 256600；2 上海市醫(yī)藥學(xué)校生物技術(shù)制藥系，上海 200135

乳腺癌目前為臨床常見的女性高發(fā)惡性腫瘤之一［1］。據(jù)最新報道顯示，目前在各種腫瘤分布中，乳腺癌患者數(shù)量的增長居高不下，發(fā)病率占女性惡性腫瘤約20%，且其病死率在女性惡性腫瘤中最高［2-3］。臨床的治療方法包括手術(shù)、化療、藥物等多種療法，目前常用的化療藥物能夠發(fā)揮明顯的抗腫瘤作用，但同時對機體也帶來了明顯的不良反應(yīng)，大劑量或長時間的治療后患者往往出現(xiàn)明顯的消化道不良反應(yīng)及骨髓抑制等，給腫瘤的治療帶來明顯的負面影響［4-6］。近幾年來，越來越多的天然產(chǎn)物被研究用于抗腫瘤治療，研究內(nèi)容包括抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲及相應(yīng)的分子機制等［7-8］。

雙去甲氧基姜黃素（bisdemethoxycurcumin，BDMC）屬于姜黃素類化合物，是從植物姜黃根莖中提取得到的天然產(chǎn)物，具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤等［9］。據(jù)報道，BDMC 對肺癌、肝癌、卵巢癌及黑色素瘤等多種動物腫瘤模型均具有明顯的抑制作用［10］。目前關(guān)于BDMC 對乳腺癌小鼠4T1 細胞及荷瘤小鼠模型的作用未見報道。因此，我們擬采用小鼠乳腺癌4T1 細胞及其荷瘤小鼠，觀察BDMC 對其的影響并探討作用機制，旨在為BDMC 在臨床上用于乳腺癌的治療提供一定的參考。

材料與方法

1、藥品與試劑

BDMC（B3347），規(guī)格25 g/瓶，東京化成工業(yè)株式會社；RPMI1640 培養(yǎng)基，美國Hyclone 公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；CCK8、TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、β-actin 抗體，碧云天生物技術(shù)公司；Bax、Bcl-2 及 cleaved caspase-3 抗體，美國 Santa Cruz公司；其余試劑均為分析純。

2、細胞及實驗動物

小鼠乳腺癌4T1 細胞，武漢普諾賽生命科技有限公司。SPF 級雌性 BALB/c 小鼠，6～8 周齡，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SYXK（魯）20170005。

3、CCK8法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期的4T1 細胞按密度1×105/ml 接種于96 孔培養(yǎng)板中，100 μl/孔。過夜培養(yǎng)后，加入不同濃度（3、9、27 μM）的BDMC 于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h，然后每孔加10 μl CCK8 溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育3 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光值，計算細胞活性。

4、TUNEL染色檢測細胞凋亡

實驗分為 Control 組及不同劑量（9、27 μM）BDMC組，BDMC 給藥24 h 后。首先加入4%多聚甲醛進行固定20 min，用 PBS 緩沖液洗 5 次，10 min/次。然后于冰上加入透膜劑TritonX-100 進行孵育5 min，用PBS 緩沖液洗3 次，10 min/次。按照TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒說明配置TUNEL 檢測液，37 ℃避光孵育 60 min，PBS 洗 3 次，用抗熒光淬滅封片液封片，在避光的環(huán)境中將于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5、小鼠荷瘤模型的構(gòu)建及給藥

將收集的對數(shù)生長期小鼠乳腺癌細胞4T1（1×107/ml）0.1 ml 接種于小鼠第4 對乳腺皮下脂肪墊。將18 只建模成功的小鼠隨機分為 3 組，即 Control 組、10 mg/kg BDMC 組、30 mg/kg BDMC 組，每組 6 只。除 Control 組外，BDMC 組于造模后第5 天開始腹腔注射給藥，每天1 次，共給藥15 d。給藥后第 0、3、6、9、12、15 天，即每間隔3 d 測量 1 次小鼠腫瘤體積（V），測量瘤體的最長徑（a）和最短徑（b），V=ab2/2，繪制腫瘤體積變化曲線，同時記錄小鼠體質(zhì)量。最后1 次給藥后2 h處死小鼠，分離腫瘤。

6、Western blot檢測4T1細胞及腫瘤組織蛋白表達

刮取細胞或取50 mg腫瘤組織，首先加入RIPA裂解液，放置于冰上進行勻漿，隨后等待30 min 以使其裂解完全，12 000 rpm 離心10 min 取上清（離心半徑6 cm），即得到總蛋白。BCA 法檢測樣品蛋白濃度，加入loading buffer 后煮沸5 min 制樣，10%的凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，BSA 室溫封閉膜4 h；分別加入Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3 抗體4 ℃孵育過夜；再室溫加入二抗孵育2 h；凝膠成像儀（GE，LAS4000）顯影，Image J 檢測條帶灰度值。

7、統(tǒng)計方法

采用GraphPad 8.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。統(tǒng)計方式采用單因素方差分析，以P<0.05判定差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1、BDMC對4T1細胞增殖的影響

如圖 1 所示，與 Control 組相比，9、27 μM BDMC 均能明顯抑制4T1 細胞增殖（均P<0.01）；3 μM BDMC 在一定程度上抑制4T1 細胞增殖，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果表明BDMC 能夠劑量依賴性抑制4T1 細胞的活性，說明BDMC能夠能明顯抑制4T1細胞的增殖。

圖1 BDMC對小鼠乳腺癌4T1細胞增殖的影響

2、BDMC對4T1細胞凋亡的影響

如圖 2 所示，與 Control 組相比，9、27 μM BDMC 組TUNEL 陽性細胞數(shù)目明顯增加（均P<0.01）。結(jié)果表明BDMC能夠明顯誘導(dǎo)4T1細胞發(fā)生凋亡。

圖2 BDMC對小鼠乳腺癌4T1細胞凋亡的影響

3、BDMC 對4T1 乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤體積及體質(zhì)量的影響

如圖 3A 所示，與 Control 組比較，BDMC 10 mg/kg 組小鼠的腫瘤體積在第20 天時明顯降低（P<0.01）；BDMC 30 mg/kg 組小鼠的腫瘤體積在第 14、17、20 天時均明顯降低（均P<0.05）。結(jié)果表明BDMC 能夠明顯抑制4T1 乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤的生長。

如圖 3B 所示，與 Control 組相比，BDMC 10 及 30 mg/kg組小鼠的體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果表明BDMC對4T1乳腺癌荷瘤小鼠的體質(zhì)量無明顯影響。

圖3 BDMC對4T1乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤體積（A）及體質(zhì)量（B）的影響

4、BDMC 對4T1細胞及小鼠腫瘤組織Bax/Bcl-2比值及cleaved caspase-3表達的影響

如圖 4A 所示，與 Control 組比較，9、27 μM BDMC 組的Bax/Bcl-2 比值明顯增加，cleaved caspase-3 表達明顯升高（均P<0.01）。結(jié)果表明BDMC 能夠明顯激活4T1 細胞線粒體凋亡通路。

如圖 4B 所示，與 Control 組比較，BDMC 10 及 30 mg/kg組小鼠腫瘤組織Bax/Bcl-2 比值明顯增加，cleaved caspase-3表達明顯升高（均P<0.05）。結(jié)果表明BDMC能夠明顯激活4T1乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤組織線粒體凋亡通路。

圖4 BDMC 對4T1細胞及小鼠腫瘤組織Bax/Bcl-2比值及cleaved caspase-3表達的影響。A為小鼠乳腺癌4T1細胞Bax/Bcl-2比值及cleaved caspase-3表達，B為4T1乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤組織Bax/Bcl-2比值及cleaved caspase-3表達（每組6只）

討 論

近年來，天然產(chǎn)物用于抗腫瘤研究或抗腫瘤藥物的開發(fā)受到廣泛關(guān)注，其在乳腺癌的防治及機理研究應(yīng)用廣泛，同時臨床研究顯示天然產(chǎn)物可有效減輕常規(guī)治療手段所帶來的的不良反應(yīng)及并發(fā)癥，并上調(diào)機體免疫等多種功能，其治療效應(yīng)已受到廣泛關(guān)注［11-12］。

據(jù)報道，BDMC 對 HepG2、K562、A549 等多種腫瘤細胞增殖均具有明顯的抑制作用［13-15］。本研究首先通過CCK-8 法檢測BDMC 對小鼠乳腺癌4T1 細胞增殖的影響。結(jié)果顯示，BDMC 在3 μM 時對細胞增殖有一定程度的抑制作用；BDMC 在9 及27 μM 時能夠明顯劑量依賴性的抑制4T1 細胞的增殖，結(jié)果表明BDMC 能夠明顯抑制4T1 細胞的增殖且存在明顯的量效關(guān)系。

部分研究還顯示BDMC 對小鼠肝癌、肺癌等模型均具有明顯的抗腫瘤作用［16-17］。隨后，本研究觀察了BDMC 對荷4T1 小鼠乳腺癌腫瘤模型的治療作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BDMC 10及30 mg/kg組小鼠的腫瘤增長趨勢與Control組相比明顯減慢，BDMC 30 mg/kg 組小鼠腫瘤增長抑制最為顯著，表明BDMC可以有效抑制荷4T1小鼠乳腺癌腫瘤組織的生長，發(fā)揮明顯的抗腫瘤作用。同時，與Control組相比，BDMC 10 mg/kg組小鼠腫瘤體積在第20 天時明顯減小，而BDMC 30 mg/kg組小鼠腫瘤體積在第14、17、20 天時均明顯減小，表明BDMC 能夠劑量依賴性抑制荷4T1 小鼠乳腺癌腫瘤組織的生長，且BDMC 在30 mg/kg 時作用最顯著。此外，我們還檢測了小鼠的體質(zhì)量變化，結(jié)果可知，BDMC 10 及30 mg/kg 組的體質(zhì)量增長趨勢基本一致，且與Control 組相比均無明顯差異，表明BDMC 不會抑制荷4T1 乳腺癌小鼠的體質(zhì)量變化，無明顯的不良反應(yīng)。

TUNEL染色的機理為其可準(zhǔn)備識別細胞在凋亡過程中的細胞核DNA 斷裂，具有極高的靈敏度及特異度［18］。為了進一步探究BDMC 抑制4T1 細胞增殖的原因，本研究進一步用TUNEL 染色觀察BDMC 誘導(dǎo)4T1 細胞凋亡的情況。TUNEL 染色結(jié)果顯示，BDMC 9 及 27 μM 組 TUNEL 陽性細胞數(shù)目明顯增加。結(jié)果表明，BDMC能夠明顯促進4T1細胞的凋亡，且與BDMC劑量呈正相關(guān)。

近年來大量報道已指出，線粒體依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細胞凋亡通路中最為重要的通路之一，其中核心的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為線粒體依賴的信號級聯(lián)反應(yīng)［19-20］。Bcl-2 家族蛋白中Bcl-2 是抑凋亡蛋白，Bax 是促凋亡蛋白，這二者與線粒體凋亡通路的關(guān)系最緊密，是最核心的調(diào)控蛋白，而caspase-3 為線粒體凋亡通路下游的最終信號蛋白，且Bax/Bcl-2 與凋亡的程度呈正相關(guān)。Bcl-2、Bax 蛋白是線粒體凋亡通路啟動的上游蛋白，其表達發(fā)生變化后線粒體膜的通透性即發(fā)生改變，過度表達后開始活化caspase-3 生成cleaved caspase-3，最終此通路被激活，細胞發(fā)生凋亡［21］。為明確BDMC 促進腫瘤細胞凋亡的具體機制，本研究通過Western blot 檢測了 4T1 細胞及小鼠腫瘤組織 Bax、Bcl-2 及cleaved caspase-3 表達。結(jié)果顯示，BDMC 10、30 mg/kg 組4T1 細胞的Bax/Bcl-2 比值與Control 組相比明顯增加，cleaved caspase-3 表達與Control 組相比明顯升高；同時，BDMC 10、30 mg/kg 組小鼠腫瘤組織的Bax/Bcl-2 比值與Control 組相比也明顯增加，cleaved caspase-3 表達與Control組相比也明顯升高。這就說明了BDMC 可能通過促進4T1乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤細胞凋亡進而抑制腫瘤的生長，其機制可能與其上調(diào)Bax/Bcl-2 比值及cleaved caspase-3 蛋白表達從而激活線粒體凋亡通路有關(guān)。

綜上所述，BDMC對4T1細胞及乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤生長具有明顯的抑制作用，且對體質(zhì)量增長無明顯影響。深入研究發(fā)現(xiàn)，BDMC 可能是通過上調(diào)Bax/Bcl-2 比值及cleaved caspase-3 蛋白表達從而激活線粒體凋亡通路有來發(fā)揮其抗腫瘤作用的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突