結(jié)腸癌患者腸黏膜組織定植菌群的結(jié)構(gòu)變化及其臨床意義

王 博

結(jié)腸癌是發(fā)生在結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率居惡性腫瘤第3位，病死率居惡性腫瘤第5位，40～50歲為高發(fā)年齡，男女之比為2∶1～3∶1[1]。隨著人類生活水平提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，結(jié)腸癌發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重影響人類生命安全[2]。腸道定植菌群在生理狀態(tài)下處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)這種平衡遭到打破，腸道定植菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，腸黏膜免疫調(diào)節(jié)紊亂，腸道屏障功能出現(xiàn)異常，導(dǎo)致組織惡變。有研究認(rèn)為[3]腸道定植菌群失調(diào)是誘發(fā)結(jié)腸癌的關(guān)鍵因素，但由于受到實(shí)驗(yàn)條件、儀器精度、自身能力、研究方法等因素限制，現(xiàn)階段關(guān)于腸道定植菌群在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中作用的研究較少。因此本研究探討結(jié)腸癌患者腸黏膜組織定植菌群的結(jié)構(gòu)變化及其與病情程度的相關(guān)性，以期為臨床防治結(jié)腸癌提供新的方向，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年11月至2020年11月我院收治的97例結(jié)腸癌患者為病例組，同期我院收治的97例結(jié)腸腺瘤患者為對照組。病例組：男性69例，女性28例；年齡40～80歲，平均年齡(56.23±5.45)歲；體質(zhì)量指數(shù)(23.49±3.33)kg/m2；吸煙史34例；飲酒史39例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期46例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。對照組：男性70例，女性27例；年齡40～78歲，平均年齡(56.47±5.58)歲；體質(zhì)量指數(shù)(23.51±3.25)kg/m2；吸煙史35例；飲酒史40例。2組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史等一般資料無顯著差異(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①2組患者經(jīng)病理活檢確診；②入院前未接受任何抗結(jié)腸癌、結(jié)腸腺瘤治療；③依從性好，能配合完成本研究；④所有研究對象對本研究內(nèi)容知情了解，并簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病歷資料不詳細(xì)；②心、肝、腎、肺等重要臟器功能不全；③哺乳期或妊娠期女性；④合并其他腫瘤、其他胃腸道疾病、過敏性疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病、傳染性疾病、心腦血管疾病、精神系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病。本研究上報(bào)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)并獲得批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

記錄所有研究對象入院時(shí)的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史等一般資料，收集病例組手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織和對照組手術(shù)切除的結(jié)腸腺瘤組織，采用基因組DNA提取試劑盒(北京凱瑞基生物科技有限公司)提取2組患者腸黏膜組織中基因組DNA，所提取的DNA采用分光光度計(jì)(東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司)檢測其濃度和純度，對細(xì)菌16srRNA基因V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為：Primer (2 μM)3 μL；Phusion Master Mix (2×)15 μL；gDNA 10 μL，H2O2μL，總體積30 μL；PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性1 min，98℃變性10 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，39次循環(huán)。細(xì)菌16SrDNA的引物為：515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')/806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(上海勱瑞生物科技有限公司)對PCR產(chǎn)物純化，應(yīng)用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(美國Promega公司)對PCR產(chǎn)物定量，應(yīng)用Illumina Miseq平臺(tái)(武漢華大基因公司)進(jìn)行高通量測序，應(yīng)用COPE軟件(北京奧維森基因科技有限公司)統(tǒng)計(jì)樣品序列數(shù)目，在0.97相似度下應(yīng)用QIIME序列分析軟件(北京環(huán)中睿馳科技有限公司)將序列聚類為用于物種分類的OTUs，結(jié)合物種組成信息結(jié)果，分析2組患者腸黏膜組織定植菌群結(jié)構(gòu)及豐度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組患者腸黏膜組織定植菌群結(jié)構(gòu)差異

門水平：病例組患者腸黏膜組織中厚壁菌門豐度顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；病例組患者腸黏膜組織中變形菌門豐度顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)屬水平：病例組患者腸黏膜組織中真桿菌屬豐度顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；病例組患者腸黏膜組織中梭桿菌屬豐度顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者腸黏膜組織定植菌群結(jié)構(gòu)差異

2.2 不同臨床分期的結(jié)腸癌患者腸黏膜組織定植菌群結(jié)構(gòu)差異

門水平：Ⅲ～Ⅳ期結(jié)腸癌患者腸黏膜組織中厚壁菌門豐度顯著低于Ⅰ～Ⅱ期結(jié)腸癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期結(jié)腸癌患者腸黏膜組織中變形菌門豐度顯著高于Ⅰ～Ⅱ期結(jié)腸癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。屬水平Ⅲ～Ⅳ期結(jié)腸癌患者腸黏膜組織中真桿菌屬豐度顯著低于Ⅰ～Ⅱ期結(jié)腸癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期結(jié)腸癌患者腸黏膜組織中梭桿菌屬豐度顯著高于Ⅰ～Ⅱ期結(jié)腸癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床分期的結(jié)腸癌患者腸黏膜組織定植菌群結(jié)構(gòu)差異

2.3 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的結(jié)腸癌患者腸黏膜組織定植菌群結(jié)構(gòu)差異

門水平：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者腸黏膜組織中厚壁菌門豐度顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者腸黏膜組織中變形菌門豐度顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。屬水平：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者腸黏膜組織中真桿菌屬豐度顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者腸黏膜組織中梭桿菌屬豐度顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的結(jié)腸癌患者腸黏膜組織定植菌群結(jié)構(gòu)差異

2.4 spearman相關(guān)性分析

結(jié)腸癌患者腸黏膜組織中變形菌門、梭桿菌屬豐度與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)；結(jié)腸癌患者腸黏膜組織中厚壁菌門、真桿菌屬豐度與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(表4)。

表4 結(jié)腸癌患者腸黏膜組織定植菌與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

3 討論

結(jié)腸癌早期通常表現(xiàn)為消化不良、腹脹、排便習(xí)慣改變等無特異性的癥狀，隨著病情進(jìn)一步發(fā)展可出現(xiàn)肺、腦、肝、骨等組織臟器轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)腸梗阻、淋巴結(jié)腫大、肺水腫、黃疸、腹腔積液等轉(zhuǎn)移征象，危及患者生命?，F(xiàn)階段臨床治療結(jié)腸癌主要采用手術(shù)為主、放化療為輔的綜合性治療方案，能夠緩解臨床癥狀，縮小原發(fā)癌灶，降低臨床分期，提高生存率，但因結(jié)腸解剖關(guān)系復(fù)雜，手術(shù)不能徹底切除，癌細(xì)胞可向腹腔內(nèi)種植，沿腸壁浸潤、擴(kuò)散，沿手術(shù)切口面轉(zhuǎn)移，患者往往預(yù)后不良。因此探討結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制對提升患者預(yù)后有重要意義。

結(jié)腸癌發(fā)病是一個(gè)多步驟、多因素、多途徑的過程，涉及分子遺傳學(xué)改變和組織形態(tài)學(xué)變化，家族史、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸息肉、高脂肪飲食、低纖維素飲食等均為結(jié)腸癌的高危因素[4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，宏基因組學(xué)的深入研究，二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，腸道定植菌群在結(jié)腸癌發(fā)病過程中的作用成為近年來臨床的研究熱點(diǎn)。腸道定植菌群是腸道內(nèi)的正常菌群，定植于腸道黏膜上，與機(jī)體生理代謝、腸道穩(wěn)態(tài)、腸黏膜免疫調(diào)節(jié)關(guān)聯(lián)密切。腸道定植菌群在生理狀態(tài)下處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)這種平衡遭到打破，腸道定植菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，腸黏膜免疫調(diào)節(jié)紊亂，腸道屏障功能出現(xiàn)異常，導(dǎo)致組織惡變[5]。厚壁菌門是人體健康狀態(tài)下腸道內(nèi)的專性厭氧菌，對維持宿主健康發(fā)揮著十分重要的作用[6]。丁酸鹽產(chǎn)生菌是一類腸道內(nèi)可發(fā)酵產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸的細(xì)菌，能夠維持腸上皮細(xì)胞完整性，保護(hù)宿主腸壁，調(diào)節(jié)腸道免疫應(yīng)答，為腸道提供能量，減少DNA氧化損傷，降低腸道炎癥，減弱致癌酶活性，抑制腫瘤形成。真桿菌屬是目前已知的丁酸鹽產(chǎn)生菌之一，被認(rèn)為是有益菌[7]。梭桿菌屬是一種革蘭陰性專性厭氧菌，具有侵襲、粘附、促炎癥發(fā)生的作用，與炎性腸病發(fā)病有關(guān)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)[9]梭桿菌屬能夠通過E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和β-連環(huán)素(β-catenin)信號(hào)促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)病。變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，其中γ-變形菌綱包含了很多重要的條件致病菌，可引起腸道微環(huán)境改變，導(dǎo)致腸道定植菌群整體結(jié)構(gòu)失衡[10]。本研究顯示病例組患者腸黏膜組織中厚壁菌門、真桿菌屬豐度顯著低于對照組，病例組患者腸黏膜組織中變形菌門、梭桿菌屬豐度顯著高于對照組，提示結(jié)腸癌患者腸黏膜組織定植菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，出現(xiàn)了有益菌減少、有害菌增加的腸道定植菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)現(xiàn)象，這與既往研究報(bào)道一致[3]，我們推測腸道定植菌群失調(diào)可能是誘發(fā)結(jié)腸癌的因素之一。本研究顯示結(jié)腸癌患者腸黏膜組織中變形菌門、梭桿菌屬豐度與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，結(jié)腸癌患者腸黏膜組織中厚壁菌門、真桿菌屬豐度與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，提示腸道定植菌群失調(diào)可能是導(dǎo)致結(jié)腸癌病情進(jìn)展的間接原因。

綜上所述，結(jié)腸癌患者腸黏膜組織定植菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，出現(xiàn)了有益菌減少、有害菌增加的腸道定植菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)現(xiàn)象，且這種失調(diào)現(xiàn)象隨著結(jié)腸癌病情程度的增加而加重，腸道黏膜菌群結(jié)構(gòu)鑒定有望成為結(jié)腸癌高風(fēng)險(xiǎn)人群篩查的途徑之一，調(diào)節(jié)腸道菌群有望成為防治結(jié)腸癌的新方法。鑒于本研究納入病例數(shù)較少，研究時(shí)間較短，未對患者性別、年齡、種族、長期飲食習(xí)慣等臨床資料進(jìn)一步分析，因此有待進(jìn)一步研究，更加確切了解腸道定植菌群在結(jié)腸癌發(fā)生及進(jìn)展過程中的作用機(jī)制，為結(jié)腸癌的診斷、治療提供更為有力的證據(jù)。