EGFR和Cyclin D1在喉癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性

楊慶軍

喉癌占所有類型癌癥的1%～5%[1]，隨著發(fā)病率的增加，喉癌在耳鼻喉科惡性腫瘤中排名第三，占所有耳鼻喉科惡性腫瘤的7.9%～35%，并且90%為鱗狀細(xì)胞癌[2-3]。喉癌的發(fā)生機(jī)制目前仍有待闡明，相關(guān)研究表明，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)與腫瘤的發(fā)生、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后生存率密切相關(guān)[4-5]。然而，EGFR和Cyclin D1在喉癌中的相關(guān)性及其在喉癌發(fā)生發(fā)展中是否具有協(xié)同作用尚未見(jiàn)報(bào)道，研究EGFR和Cyclin D1在喉癌中表達(dá)水平的相關(guān)性以及與患者臨床特征的關(guān)系，有助于闡明喉癌的生物學(xué)特征。本研究通過(guò)使用免疫組織化學(xué)染色和統(tǒng)計(jì)分析確定EGFR和Cyclin D1在喉癌組織中的表達(dá)與疾病臨床特征之間的關(guān)聯(lián)，為評(píng)估喉癌的嚴(yán)重程度和選擇最合適的治療方案提供幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015年至2019年我院耳鼻喉科手術(shù)采集的46例原發(fā)性喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)和20例聲帶息肉(VCP)石蠟包埋組織標(biāo)本，分別作為研究組和對(duì)照組。LSCC患者均使用電子喉鏡及病理學(xué)檢查確定腫瘤分期，并采用第8版國(guó)際喉癌控制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期系統(tǒng)(TNM)分期[6]，T1～T2期19例(41.30%)，T3期22例(47.83%)，T4期5例(10.87%)。治療前無(wú)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例(93.48%)，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3例(6.52%)，均為N1期。治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移28例(60.87%)。所有LSCC患者均行手術(shù)治療，包括喉部分切除術(shù)、全喉切除術(shù)和頸淋巴結(jié)清掃術(shù)。T4期和部分T3期患者采用鈷-60放射治療或5-氟尿嘧啶+順鉑化療作為輔助治療，所有病例隨訪5年以上。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

使用Super Vision IHC試劑盒(武漢博斯特生物科技有限公司)將標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)(IHC)染色。樣品在4 ℃下用4%多聚甲醛固定約24 h，通過(guò)分級(jí)乙醇脫水，用二甲苯洗滌并包埋在石蠟中。然后5 μm連續(xù)切片，在二甲苯和降醇系列中進(jìn)行常規(guī)脫蠟和再水化，并在去離子水中沖洗。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶用去離子水中的3%過(guò)氧化氫淬滅。用pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液在98℃下孵育10 min，然后與10%山羊血清封閉溶液(武漢博士德生物科技有限公司)在室溫下孵育20 min，抗EGFR抗體(OriGene Technologies)，Cyclin D1(福州邁欣生物科技有限公司)在4 ℃下過(guò)夜。用PBS洗滌兩次后，將辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合兔抗免疫球蛋白G抗體在37℃中孵育30 min。 3,3'-二氨基聯(lián)苯胺染色后，切片在室溫下用蘇木精復(fù)染2 min，脫水并貼在蓋玻片上。

1.3 成果評(píng)估

細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中的黃色、棕色及褐色染色為EGFR和Cyclin D1陽(yáng)性信號(hào)。半定量評(píng)分分析：隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×200)，使用光學(xué)顯微鏡觀察各視野計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：0分：<25%陽(yáng)性細(xì)胞；1分：25%～49%陽(yáng)性細(xì)胞；2分：50%～74%陽(yáng)性細(xì)胞；3分：≥75%陽(yáng)性細(xì)胞。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分：無(wú)顯色；1分：淺黃色；2分：橙色；3分：棕褐色。最后通過(guò)上述兩種評(píng)分相加獲得最終分?jǐn)?shù)，然后將其除以2。將結(jié)果定義為：0分：陰性(-)；0.5～1.0分：弱陽(yáng)性(+)；1.5～2.0分：陽(yáng)性(++)；2.5～3.0分：強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。陰性和弱陽(yáng)性表達(dá)定義為低表達(dá)；陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)定義為高表達(dá)。評(píng)估患者2年總生存率以及EGFR和Cyclin D1表達(dá)與患者生存率的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，χ2檢驗(yàn)分析喉癌患者的性別、年齡、臨床分期、治療后轉(zhuǎn)移狀況與基因表達(dá)的關(guān)系。用spearman相關(guān)分析基因表達(dá)水平之間的關(guān)系。采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(Log Rank Test)比較各組生存率，并使用Kaplan-Meier曲線進(jìn)行喉癌患者的生存分析，以評(píng)價(jià)EGFR和Cyclin D1表達(dá)水平與患者生存率的相關(guān)性。所有檢驗(yàn)均為雙尾，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR和Cyclin D1染色結(jié)果

棕色染色的EGFR主要位于喉癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。棕褐色染色的Cyclin D1主要位于喉癌細(xì)胞的細(xì)胞核中，聲帶息肉組織中EGFR和cyclin D1的表達(dá)很低。

EGFR和Cyclin D1在喉癌組織中的高表達(dá)率分別為71.7%(33/46)和52.2%(24/46)，在聲帶息肉中的高表達(dá)率分別為10.0%(2/20)和5.0%(1/20)。喉癌組織和聲帶息肉組織中EGFR和Cyclin D1表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.332、13.183，P均<0.001)。

2.2 EGFR和Cyclin D1與臨床特征的關(guān)系

EGFR和Cyclin D1的表達(dá)水平與喉癌臨床分期和治療反應(yīng)密切相關(guān)(P均<0.05)，EGFR和Cyclin D1的表達(dá)與患者年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 EGFR、Cyclin D1表達(dá)與喉癌臨床特征的關(guān)系(例，%)

2.3 喉癌組織中EGFR和Cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性

EGFR和Cyclin D1在喉癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(γ=0.356，P=0.015)，見(jiàn)表2。

表2 喉癌組織中EGFR與Cyclin D1的相關(guān)性/例

2.4 喉癌臨床特征及組織中EGFR和Cyclin D1的表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

使用Kaplan-Meier曲線進(jìn)一步分析EGFR和Cyclin D1表達(dá)水平與患者生存率的相關(guān)性，結(jié)果顯示 ，喉癌患者生存率與EGFR(χ2=4.261，P=0.039)和Cyclin D1(χ2=6.219，P=0.013)的表達(dá)水平有關(guān)，見(jiàn)圖1。

圖1 EGFR和Cyclin D1的表達(dá)與患者生存率的相關(guān)性

2.5 喉癌患者生存率的COX回歸分析

COX回歸分析表明，治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移與患者較差的生存率密切相關(guān)(P<0.001)。較高的TNM分期與患者較差的生存率密切相關(guān)，TNMⅠ～Ⅱ 期P=0.001，TNM Ⅲ期P=0.017，TNM Ⅳ期P<0.001。見(jiàn)表3。

表3 喉癌患者生存率的COX回歸分析

3 討論

EGFR是一種配體介導(dǎo)的多功能跨膜糖蛋白，存在于除人體造血系統(tǒng)外的大多數(shù)組織的細(xì)胞膜上，EGFR對(duì)EGF有很高的親和力，這種相互作用具有時(shí)間和溫度依賴性、飽和性和可逆性[7]。EGFR激活酪氨酸激酶后，通過(guò)RAS-RAF-MEK-MAPK、PI3K-PKC-IKK和JAK-STAT通路實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)放大，將細(xì)胞外有絲分裂信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，從而調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長(zhǎng)、分化，并促進(jìn)細(xì)胞損傷修復(fù)。EGFR 在許多實(shí)體瘤中高度表達(dá)，并且與腫瘤進(jìn)展、細(xì)胞凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-9]。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，EGFR是喉癌發(fā)生發(fā)展的重要抗癌靶點(diǎn)，抑制EGFR可以限制喉鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)，此類藥物在與其他藥物聯(lián)合使用時(shí)可增強(qiáng)它們的抗癌作用[10-11]。本研究結(jié)果表明，與聲帶息肉組織相比，喉癌中EGFR表達(dá)顯著增加。此外，在較高TNM分期的組織中發(fā)現(xiàn)EGFR表達(dá)增加，喉癌治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者中EGFR表達(dá)(88.9%)顯著高于未出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者(60.7%)，說(shuō)明EGFR表達(dá)可能促進(jìn)喉癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

Cyclin D1與CDK4或CDK6相互作用以誘導(dǎo)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)展到S期并促進(jìn)細(xì)胞分裂或轉(zhuǎn)化[12]。Cyclin D1的異常表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞周期失衡，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[13]。先前的研究證實(shí)Cyclin D1與惡性腫瘤的演變密切相關(guān)[14]。使用 LSCC異種移植模型的體內(nèi)研究表明，Cyclin D1下調(diào)可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。在本研究中，與聲帶息肉組織相比，喉癌組織中Cyclin D1的表達(dá)水平顯著升高。此外，較高的TNM分期與Cyclin D1的高表達(dá)相關(guān)，喉癌治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者中Cyclin D1的表達(dá)(60.0%)較未復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者(29.2%)顯著增加，表明Cyclin D1可能在喉癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起一定作用。

本研究結(jié)果表明，喉癌組織中EGFR和Cyclin D1的表達(dá)水平均明顯高于聲帶息肉組織，且與喉癌的TNM分期及治療后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這兩種因子在喉癌中的表達(dá)水平呈正相關(guān)，表明EGFR和Cyclin D1可能具有協(xié)同作用，該作用的機(jī)制可能為EGFR激活RAS/Raf通路，通過(guò)MAPK途徑誘導(dǎo)Cyclin D1的表達(dá)和激活，從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入S期并啟動(dòng)增殖。然而，有研究表明EGFR和Cyclin D1在喉癌中的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性[16]，其原因可能是EGFR和Cyclin D1只是參與癌變過(guò)程的眾多復(fù)雜細(xì)胞信號(hào)通路的一部分，在喉癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，這些信號(hào)通路具有不同的表達(dá)階段。用Cox回歸模型對(duì)生存率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)較高的TNM分期和治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與喉癌患者較差的生存率密切相關(guān)。不同TNM分期患者的生存率有顯著差異，提示喉癌的臨床分期和治療反應(yīng)是影響生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而EGFR和CyclinD 1高表達(dá)是影響生存率的相對(duì)危險(xiǎn)因素。

綜上所述，EGFR和Cyclin D1的表達(dá)水平與患者臨床分期密切相關(guān)，其異常表達(dá)可能促進(jìn)喉癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，從而影響患者的生存率。臨床上可通過(guò)檢測(cè)EGFR和Cyclin D1基因的表達(dá)來(lái)判斷患者生存率，結(jié)合特異性靶向EGFR和Cyclin D1基因重組治療可減少腫瘤殘留，防止復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。本研究的主要局限性是男女比例為45∶1，盡管LSCC在男性中更為普遍，但依舊高于以前的研究[17]?？赡苁怯捎趩沃行牡牟±龜?shù)量相對(duì)較少造成的，未來(lái)應(yīng)該進(jìn)行多中心的研究。