經(jīng)內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下膽道引流術(shù)治療低位惡性梗阻性黃疸后患者血清CK18 水平變化及其臨床意義

袁殿寶 吳 娜 高會(huì)斌

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，張家口 075000）

梗阻性黃疸（OJ）是一種由膽道梗阻引起的常見外科疾病，而膽道梗阻是由膽道的良惡性病變引起的［1］。然而無(wú)論是良性還是惡性病變，膽汁阻塞都會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷［2］。眾所周知，凋亡通路在不同類型的慢性肝損傷中被激活［3］，導(dǎo)致功能性肝細(xì)胞數(shù)量下降［4］。而膽管減壓后，膽管的生理和形態(tài)學(xué)特征迅速恢復(fù)正常。對(duì)于低位OJ，更適合選擇經(jīng)內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下膽道引流術(shù)（EUS?BD）。因此，準(zhǔn)確估計(jì)肝細(xì)胞在整個(gè)過(guò)程中的損傷程度對(duì)于預(yù)測(cè)臨床病程和可能的術(shù)后并發(fā)癥非常重要。細(xì)胞角蛋白18（CK18）是一種間質(zhì)性纖維蛋白，約占上皮組織、胰腺外分泌組織、小腸和其他上皮組織總蛋白的5%［5］。在肝細(xì)胞凋亡階段，由于胱天冬氨酸蛋白酶的切割作用，CK18 及其片段被釋放到細(xì)胞外液，因此可以作為急/慢性肝細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物［6］。本研究旨在評(píng)價(jià)低位惡性梗阻性黃疸（MOJ）患者經(jīng)EUS?BD 治療前后血清CK18水平的動(dòng)態(tài)變化，以及與實(shí)驗(yàn)室參數(shù)的相關(guān)性，從而為CK18 在胰膽疾病中的應(yīng)用價(jià)值提供新的思路，并試圖幫助臨床醫(yī)生制定更合理的治療策略。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年8月~2021年3月在我院消化內(nèi)科接受EUS?BD治療的22例低位MOJ患者作為研究對(duì)象，選擇經(jīng)放射學(xué)或病理學(xué)檢查證實(shí)的臨床診斷病例；具有完整臨床相關(guān)資料。除壺腹周圍及胰膽管病變外，其他原發(fā)性疾病如畸胎瘤、心力衰竭、卵巢囊腫、橋本甲狀腺腫等均排除。患者包括16例男性和6例女性，年齡在44~87歲之間（平均年齡：66.12±11.41歲）。所有患者及家屬均對(duì)本研究知情，并簽署書面知情同意書。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

所有患者均行血常規(guī)、肝腎功能等實(shí)驗(yàn)室檢查和肝膽超聲等影像檢查，排除手術(shù)禁忌?；颊呓邮艹Ｒ?guī)補(bǔ)液以平衡體液、電解質(zhì)并維持酸堿平衡和營(yíng)養(yǎng)。所有EUS?BD 手術(shù)均由經(jīng)驗(yàn)豐富的內(nèi)窺鏡工作者根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議，使用TJF260V 十二指腸鏡（日本奧林巴斯）進(jìn)行。所有EUS?BD 病例均在全身麻醉下進(jìn)行，除非不能安全操作（缺乏無(wú)血管窗或膽總管直徑<10 mm），否則膽總管十二指腸吻合術(shù)（CDS）是首選技術(shù)。通過(guò)經(jīng)十二指腸途徑定位膽管。多普勒信號(hào)用于識(shí)別無(wú)血管窗，初次穿刺用電烙針尖。該裝置還預(yù)裝了0.035導(dǎo)向絲，以允許在初次穿刺后立即放置導(dǎo)向絲。一旦導(dǎo)管尖端完全進(jìn)入膽總管，遠(yuǎn)端卷邊在超聲引導(dǎo)下展開。然后將導(dǎo)管收回，貼在中心組織近側(cè)壁上，形成貼壁。近端凸緣部署在回聲內(nèi)窺鏡的工作通道內(nèi)，然后在導(dǎo)管同時(shí)緩慢推進(jìn)的情況下，緩慢地抽出，以確保近端十二指腸凸緣內(nèi)部的部署。最后，通過(guò)內(nèi)窺鏡顯示膽汁流經(jīng)支架的情況，確定支架的正確位置。引流成功后，TB 水平降低到正常值的兩倍以下。術(shù)后姑息性治療如化療、放療、免疫治療或介入治療等均有利于引流后治療。

1.3 觀察指標(biāo)

收集患者的人口學(xué)資料、影像學(xué)資料、病理結(jié)果、手術(shù)日期、手術(shù)類型、血常規(guī)、肝功能、診斷及血清學(xué)結(jié)果。分別于術(shù)前、術(shù)后1d、7d 及出院當(dāng)天測(cè)定各項(xiàng)生化指標(biāo)。所有血液指標(biāo)和CK18水平測(cè)定標(biāo)本于入院后次日禁食12h 后，采用靜脈穿刺法采集5mL 血液樣本于真空采血管中。樣品送實(shí)驗(yàn)室后，離心分離血清（10 min，3000 r/min），保存在?80 ℃直至分析。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測(cè)定血清CK18濃度，Cusabio試劑盒購(gòu)自武漢某公司。變異系數(shù)均<10%。利用Beckman Coulter AU5800 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)受試者總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血清堿性磷酸酶（ALP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、γ?谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）活性及總膽紅素（TB）、直接膽紅素（DB）、總膽汁酸（TBA）、超敏C 反應(yīng)蛋白（hs?CRP）水平。所有生化指標(biāo)均在同一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制在控制范圍內(nèi)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS26.0 軟件處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的數(shù)值變量以（‘x±s）的形式表示，采用t檢驗(yàn)。血清學(xué)指標(biāo)用中位數(shù)（IQR）表示，2 組比較采Mann?WhitneyU 檢驗(yàn)。采用Spearman 秩相關(guān)法評(píng)價(jià)CK18 與其他常見實(shí)驗(yàn)室變量的相關(guān)性。術(shù)后1d、7d和出院時(shí)的數(shù)據(jù)與術(shù)前基線值差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義通過(guò)重復(fù)測(cè)量方差分析進(jìn)行評(píng)估。二分類變量以率（頻率）表示和卡方檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清生化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)

各項(xiàng)血清生化指標(biāo)（包括TP、ALB、ALP、ALT、AST、GGT、TB、DB、TBA、hs?CRP、CK18）水平在4個(gè)配對(duì)時(shí)間點(diǎn)之間差異顯著（P<0.05）。術(shù)后1d、7d、出院時(shí) 血清ALP、AST、GGT、TB、DB、TBA、CK18 水平與術(shù)前基線水平相比差異有顯著性（P<0.05）。術(shù)后7d 及出院時(shí) 血清TB、DB、CK18 水平與術(shù)后1d 比較差異有顯著性（P<0.05）。術(shù) 后 出 院 當(dāng) 天 血 清ALB、ALP、AST、GGT、TB、DB 和hs?CRP 水平與術(shù)后7d 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1）。如表1 所示，各組酶學(xué)指標(biāo)（ALP、ALT、AST、GGT、CK18）、膽紅素指標(biāo)（TB、DB）和TBA 水平逐漸下降，而hs?CRP 水平先升后降。

表1 血清生化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)

2.2 血清CK18 水平與其他血生化指標(biāo)的相關(guān)性

采用Spearman秩相關(guān)性分析，基線時(shí)CK18水平與TB呈顯著正相關(guān)（r=0.463，P=0.035），術(shù)后1d時(shí)，血清CK18水平與hs?CRP呈顯著負(fù)相關(guān)（r=?0.600，P=0.004），與TB（r=0.558，P=0.009）和DB（r=0.509，P=0.019）呈顯著正相關(guān)。術(shù)后7d時(shí)，血清CK18水平與hs?CRP呈顯著負(fù)相關(guān)（r=?0.605，P=0.005），與TB（r=0.559，P=0.008）和DB（r=0.455，P=0.038）呈顯著正相關(guān)。但是出院當(dāng)天血清CK18水平與其他參數(shù)無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。

2.3 血清CK18 水平與其他血生化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化率

血清CK18、ALP、ALT、AST、GGT、TB、DB、TBA水平在術(shù)后1d、7d、出院時(shí)的數(shù)值較基線值逐漸降低，而hs?CRP水平在術(shù)后1d、7d時(shí)升高，在出院時(shí)下降（圖1）。

圖1 血清CK18 水平與其他血生化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化率

2.4 血清CK18 水平與治療結(jié)局的關(guān)系

經(jīng)EUS?BD 治療后，所有患者的膽道梗阻緩解，出院。90.91%（20/22）患者在出院時(shí)血清CK18 水平低于術(shù)前水平（圖2）。

圖2 每例患者各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清CK18 水平檢測(cè)散點(diǎn)圖

3 討論

本研究探討了MOJ 患者血清CK18 水平動(dòng)態(tài)變化與膽道梗阻的關(guān)系。各時(shí)間點(diǎn)血清CK18 水平均與TB 相關(guān)，較術(shù)前基線值的變化率及動(dòng)態(tài)變化圖顯示術(shù)后血清CK18、ALP、ALT、AST、GGT、TB、DB、TBA 在膽道梗阻解除后逐漸降低。

MOJ 的特征是膽管受阻或受壓，導(dǎo)致皮膚、黏膜和鞏膜出現(xiàn)黃色色素沉著，它通常與胰腺癌、膽管癌、壺腹周圍癌或惡性肺門轉(zhuǎn)移等疾病有關(guān)［7］。MOJ 是持續(xù)性膽汁淤積的常見原因，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷和膽管上皮細(xì)胞炎癥，使黃疸相關(guān)肝膽系疾病的治療更加復(fù)雜，而且會(huì)進(jìn)一步增加術(shù)后并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)和死亡率［8］。MOJ 最主要病理因素之一為腸源性內(nèi)毒素血癥［9］。內(nèi)毒素是一種脂多糖，是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分［10］。在MOJ 中，由于缺乏膽鹽，腸粘膜屏障易被損害，破壞腸道免疫屏障功能可導(dǎo)致內(nèi)毒素通過(guò)門靜脈進(jìn)入肝臟［11］。此外，肝臟枯否細(xì)胞（KCs）的活性被抑制，其吞噬和殺傷細(xì)胞的功能受損，這意味著KCs 不能有效地去除內(nèi)毒素，從而導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，入侵的內(nèi)毒素激活細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)其分泌多種炎癥因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，造成機(jī)體損傷［12］。此外，活化的KCs 可釋放大量的氧自由基，進(jìn)一步加重MOJ 患者肝損傷［12］。普遍認(rèn)為膽汁淤積性肝損傷的機(jī)制是疏水性膽鹽及其膽酸形式的大量積累，以肝糖脫氧膽酸（GCDC）及其膽酸甘脫氧膽酸（GCDCA）為代表［13］。這些有毒物質(zhì)的累積是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡和凋亡，目前仍有爭(zhēng)議。

CK18 是一種間質(zhì)性纖維蛋白，約占肝臟、外分泌胰腺、腸和其他上皮組織總蛋白的5%［5］。在正常生理?xiàng)l件下，CK18 參與細(xì)胞凋亡、有絲分裂、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要的細(xì)胞過(guò)程，在細(xì)胞凋亡中起重要作用［14］。CK18 具有半胱天冬酶識(shí)別位點(diǎn)，可在腫瘤發(fā)病機(jī)制或化療引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程中被切割可以通過(guò)ELISA 測(cè)定法檢測(cè)到，以反映腫瘤細(xì)胞凋亡強(qiáng)度［15］。許多研究表明，在肝細(xì)胞凋亡過(guò)程中，血液中CK18 水平升高，并且CK18 水平可以作為肝細(xì)胞損傷的一個(gè)生物標(biāo)志物［16］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MOJ 患者血清CK18 水平在術(shù)前普遍較高，這預(yù)示著肝細(xì)胞凋亡損傷嚴(yán)重。在既往有實(shí)驗(yàn)性研究中提出，膽管結(jié)扎引起的梗阻性黃疸通過(guò)細(xì)胞壞死而非凋亡導(dǎo)致原發(fā)性肝細(xì)胞損傷，其細(xì)胞壞死標(biāo)志物HMGB1 和miR?122 水平增加，但CK18 水平并沒(méi)有增加［17］。因此，當(dāng)時(shí)科研人員認(rèn)為肝細(xì)胞損傷是由細(xì)胞壞死引起的，然而，他們并沒(méi)有在當(dāng)時(shí)的研究中報(bào)告膽紅素水平與HMGB1、miR?122 的相關(guān)性。另一方面，GCDC 在30?50 μmol/L 的濃度下會(huì)引起大鼠肝細(xì)胞的凋亡。我們的研究顯示，細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物CK18 在治療后降低，提示可能是膽道減壓后細(xì)胞凋亡減少。本組患者術(shù)前中位TB 水平為220.73 μmol/L，術(shù)后中位TB 水平為20.10 μmol/L，而且基線時(shí)CK18 水平與TB 呈顯著正相關(guān)。因此，可以得出結(jié)論，CK18 在MOJ 患者中的升高可以歸因于細(xì)胞凋亡。

據(jù)了解，高膽紅素水平與肝切除患者術(shù)后發(fā)病率和死亡率增加有關(guān)［17］。因此，我們也試圖確定CK18 水平升高是否對(duì)術(shù)后死亡率和發(fā)病率有預(yù)測(cè)價(jià)值，因?yàn)樵诟鱾€(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)血清CK18 水平與TB 水平一直呈正相關(guān)性。干預(yù)前血清CK18 水平升高，干預(yù)后血清CK18 水平下降。由于研究組的異質(zhì)性以及樣本數(shù)量有限，我們并不能確定CK18 對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，但是在這項(xiàng)研究中，我們?cè)噲D在臨床環(huán)境中評(píng)估梗阻性黃疸的肝細(xì)胞行為。

綜上，CK18 被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡標(biāo)志物之一，通過(guò)評(píng)價(jià)治療前后的血清CK18 水平，我們發(fā)現(xiàn)MOJ患者存在肝細(xì)胞凋亡損傷，而經(jīng)膽道減壓后這種凋亡減少。但本研究仍處于初步探索階段樣本量不足，仍需要更多的臨床研究來(lái)進(jìn)一步明確CK18 參與MOJ 發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制及臨床價(jià)值。