CLDN11 在結(jié)腸癌中的預(yù)后價值及其作為潛在免疫治療靶點的研究

操利超，張核子，余晨笛，盧曉萍，巴 穎

（深圳市核子基因科技有限公司，廣東 深圳 518071）

隨著科學(xué)的發(fā)展，結(jié)腸癌在診斷篩查、預(yù)后和治療等方面已取得了長足的進步，但其仍是世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。有研究表明[2-4]，腫瘤微環(huán)境可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中發(fā)揮著重要的作用。近年來，一些研究從腫瘤免疫微環(huán)境中挖掘多種腫瘤分子標志物，用于腫瘤的預(yù)后、診斷和免疫治療[5-8]。CLDN11 是claudin 家族的成員之一，是一種編碼蛋白基因。有研究表明，claudin 家族成員在多種腫瘤組織中均出現(xiàn)異常表達情況，且與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)[9-12]。然而，尚缺少研究全面探討CLDN11 與多種腫瘤的預(yù)后和腫瘤微環(huán)境特征之間的關(guān)聯(lián)?；诖?，本研究將以結(jié)腸癌為例，重點探討CLDN11 作為潛在的標志物與結(jié)腸癌預(yù)后、腫瘤微環(huán)境特征和免疫治療的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 結(jié)腸癌的mRNA 表達數(shù)據(jù)集和對應(yīng)的臨床信息、生存數(shù)據(jù)信息從UCSC Xena 平臺（https://xenabrowser.net/datapages/）下載，選擇隊列為GDC TCGA Colon Cancer（TCGA-COAD）?？傆?71 個樣本，其中腫瘤樣本432 個，正常樣本39 個，對應(yīng)的臨床信息包括性別、年齡、病理分期、TMN 分期、總生存時間和無病生存時間。

1.2 TIMER2.0 在線分析 使用TIMER2.0（http://timer.cistrome.org/）進行在線分析[13]。打開主頁，選擇“Exploration”菜單，點擊“Gene_DE”選項卡，在文本框中輸入“CLDN11”，點擊“Submit”按鈕，查看CLDN11 在各種腫瘤中表達情況。接著，選擇“Immune”菜單，點擊“Gene”選項卡，在“Gene Expression”文本框中輸入“CLDN11”，在“Immune Infiltrates”下選項中選擇所有的免疫細胞類型，點擊“Submit”按鈕，查看CLDN11 的表達與各種免疫細胞侵潤程度的相關(guān)性。P＜0.05 為判斷顯著性的標準。

1.3 GEPIA2 在線分析 使用GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn/）進行在線生存分析[14]。打開主頁，在左側(cè)菜單欄選擇“Expression Analysis”，選擇子菜單“Survival Analysis”進入生存分析頁面。在該頁面中，選擇“Gene”選項并填入“CLDN11”，“Methods”分別進行“Overall Survival”和“Disease Free Survival（RFS）”分析，“Datasets”每次選擇1 個數(shù)據(jù)集，其它參數(shù)默認，點擊“Plot”提交分析，即可分析CLDN11的表達水平與不同腫瘤的總生存時間和無病生存時間的相關(guān)性。其中，P＜0.05 作為CLDN11 是否可以作為獨立的預(yù)后因子的判斷標準。

1.4 CLDN11 的表達與微衛(wèi)星狀態(tài)、免疫治療靶點、結(jié)腸癌腫瘤分期的關(guān)聯(lián) 選擇TCGA-COAD 隊列中的腫瘤樣本，根據(jù)其微衛(wèi)星狀態(tài)，將樣本分為微衛(wèi)星穩(wěn)定組（MSS）、微衛(wèi)星高不穩(wěn)定組（MSI-H）和微衛(wèi)星低不穩(wěn)定組（MSI-L）。利用Kruskal-Wallis 檢驗分析比較這三組中CLDN11 表達水平的差異性。并利用R 軟件中的cor.test 分析CLDN11 的表達與CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1 和 TIGIT的表達相關(guān)性，顯著性判斷標準為P＜0.05。根據(jù)樣本的腫瘤分期信息，利用Kruskal-Wallis 檢驗和Wilcoxon 檢驗分析CLDN11 的表達與腫瘤TMN 分析、病理分期的相關(guān)性。上述分析過程利用R 語言（版本3.6.1，https://www.r-project.org/）完成。

2 結(jié)果

2.1 CLDN11 在泛癌種中的表達情況和預(yù)后分析CLDN11 在膀胱癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、結(jié)腸癌（COAD）、頭頸癌（HNSC）、腎嫌色細胞癌（KICH）、腎透明細胞癌（KIRC）、腎乳頭細胞癌（KIRP）、肝癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鱗狀細胞癌（LUSC）、前列腺癌（PRAD）、直腸癌（READ）、子宮內(nèi)膜樣癌（UCEC）等腫瘤中高表達（P＜0.05）,而在膽管癌（CHOL）和甲狀腺癌（THCA）中低表達（P＜0.05），見圖1A。對于結(jié)腸癌（COAD）、腎乳頭細胞癌（KIRP）、腎透明細胞癌（KIRC）和胃癌（STAD），低表達組（Low CLDN11 Group）的總生存時間和無病生存時間等預(yù)后指標均表現(xiàn)較好，而對于黑色素瘤（SCKM），高表達組（High CLDN11 Group）的預(yù)后表現(xiàn)較好（P＜0.05），見圖1B～圖1K。

圖1 CLDN11 在泛癌種中的表達與生存預(yù)后分析

圖1 CLDN11 在泛癌種中的表達與生存預(yù)后分析（續(xù)）

2.2 結(jié)腸癌樣本中CLDN11 的表達與免疫細胞侵潤程度的相關(guān)性分析 CLDN11 的表達水平與CD4+T細胞（CD4+TCell）、巨噬細胞（Macrophage）、中性粒細胞（Neutrophil）和樹突狀細胞（Dendritic Cell）的侵潤水平正相關(guān)（cor＞0.1，P＜0.05），見圖2。

圖2 CLDN11 的表達與免疫細胞侵潤程度的相關(guān)性

2.3 結(jié)腸癌樣本中CLDN11 的表達與微衛(wèi)星狀態(tài)、免疫治療靶點的相關(guān)性分析 CLDN11 在微衛(wèi)星穩(wěn)定組和微衛(wèi)星低不穩(wěn)定組的表達沒有明顯差異（P=0.4），而微衛(wèi)星狀態(tài)越穩(wěn)定，CLDN11 的表達水平越高（P＜0.05），見圖3A。此外，CLDN11 的表達與常見的免疫治療靶點基因的表達顯著正相關(guān)（CD274：cor=0.347，P=1.639e-15；CTLA4：cor=0.293，P=2.857e-11；HAVCR2：cor=0.489，P=3.308e-31；LAG3：cor=0.369，P=2.119e-17；PDCD1：cor=0.327，P=8.046e-14；TIGIT：cor=0.407，P=3.549e-21），見圖3B～圖3G。

圖3 CLDN11 的表達與免疫治療靶點的相關(guān)性

2.4 CLDN11 表達水平與在結(jié)腸癌腫瘤分期的關(guān)聯(lián)CLDN11 表達量越高，預(yù)示著腫瘤的體積和侵潤的范圍越大（P=0.019），腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性越高（P=0.0076），與腫瘤相關(guān)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多（P=0.0043），病理分期程度越高（P=0.013），見圖4。

圖4 CLDN11 的表達與結(jié)腸癌腫瘤分期的相關(guān)性

圖4 CLDN11 的表達與結(jié)腸癌腫瘤分期的相關(guān)性（續(xù)）

3 討論

本研究結(jié)果表明，CLDN11 在大多數(shù)腫瘤中低表達。CLDN11 由于被高度甲基化而導(dǎo)致表達下調(diào)，并通過與微管蛋白相關(guān)作用，阻斷微管蛋白的聚合和細胞遷移活動，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[15]。有研究表明[15-17]，CLDN11 在多種腫瘤中作為一種潛在的腫瘤抑制基因而發(fā)揮作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)CLDN11 可以作為多種腫瘤的獨立的預(yù)后預(yù)測因子，且在大多數(shù)腫瘤CLDN11 低表達組的預(yù)后相對良好。

在結(jié)腸癌中，本研究和既往報道的文獻[18]均表明CLDN11 低表達的患者預(yù)示著總生存期越長；而在乳腺癌中則相反，CLDN11 高表達的患者預(yù)后相對較差[19，20]。其次，在結(jié)腸癌中，CLDN11 的表達水平越高，CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的侵潤水平侵潤越明顯，這幾種免疫細胞在抗腫瘤免疫中有著重要的調(diào)控作用。Borst J 等[21]概述了介導(dǎo)CD4+T 細胞調(diào)控的細胞動力學(xué)和膜受體，可增強腫瘤內(nèi)細胞毒性T 淋巴細胞（scytotoxic T lymphocytes，CTL）的抗腫瘤活性。有研究表明[22]，巨噬細胞是具有高度可塑性的細胞，具有多種功能，包括組織發(fā)育和體內(nèi)平衡、清除細胞碎片、清除病原體和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等，以巨噬細胞為基礎(chǔ)，減少抗炎性巨噬細胞并增加促炎（抗腫瘤）巨噬細胞，達到腫瘤免疫治療的目的。

在腫瘤微環(huán)境中，中性粒細胞具有不同的功能，能夠?qū)Πò┌Y在內(nèi)的各種炎癥信號做出應(yīng)答反應(yīng)，對腫瘤患者的預(yù)后會有一定的影響[23]。樹突狀細胞是一種異質(zhì)性白細胞群，由驅(qū)動特定類型免疫反應(yīng)的不同亞群組成，能啟動和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而達到抗腫瘤免疫反應(yīng)的目的[24]。因此，通過調(diào)控CLDN11 的表達水平，可間接調(diào)控抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而達到免疫治療的目的。此外，在結(jié)腸癌患者中，CLDN11 的表達水平越低，微衛(wèi)星狀態(tài)越不穩(wěn)定。有研究表明，微衛(wèi)星高不穩(wěn)定患者對免疫檢查點抑制劑越敏感，將從免疫治療中獲益[25-27]，且CLDN11 的表達與多種常見的免疫治療靶點基因的表達呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，進一步表明CLDN11 可作為潛在的免疫治療靶點。另外，在結(jié)腸癌中，CLDN11 的表達水平與腫瘤的增值、轉(zhuǎn)移和侵襲呈顯著正相關(guān)，表明CLDN11 可作為結(jié)腸癌分期等級的預(yù)測因子。

然而，本研究也存在一些不足之處：首先，本研究還需要更多的樣本隊列來進行交叉實驗驗證；其次，CLDN11 的異常表達對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的影響尚待進一步開展機制研究和探討；最后，CLDN11 作為潛在的免疫治療靶點是否具有臨床價值尚待開展臨床實驗驗證和作用機制研究。

綜上所述，CLDN11 在評估結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)風險分層、腫瘤分期、免疫治療等方面具有潛在的應(yīng)用價值。