柚皮素對(duì)腦缺血損傷小鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體自噬的影響實(shí)驗(yàn)研究

王凱華，楊鑫勇，鄭光珊，陳真珍，覃 輝，黃建民

(1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530200；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011)

腦卒中是一種嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病，其中缺血性卒中約占85%。我國缺血性卒中的發(fā)病率遠(yuǎn)高于西方國家，近年來其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、致殘率和病死率明顯增高，且發(fā)病年齡逐步年輕化，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本病病理基礎(chǔ)多為動(dòng)脈粥樣硬化，腦組織血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致局部腦組織缺血缺氧和壞死。目前研究表明缺血性卒中時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞損傷受炎癥[1]、細(xì)胞凋亡[2]、興奮性氨基酸毒性[3]、氧化應(yīng)激等途徑調(diào)控[4]，而近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬是腦缺血病理過程中重要的保護(hù)機(jī)制,已成為腦缺血損傷潛在的治療靶點(diǎn)[5]。

缺血性卒中屬于中醫(yī)學(xué)中風(fēng)病范疇，其病機(jī)不外“風(fēng)、火、痰、瘀、虛”五端，屬于難治性疾病的范疇，其病機(jī)為年老體衰，或久病氣血虧虛。臨床上缺血性中風(fēng)風(fēng)痰阻絡(luò)證多見，且常夾濕、夾瘀，臨床以經(jīng)典方劑溫膽湯治療中風(fēng)風(fēng)痰阻絡(luò)證獲得良好療效。枳實(shí)以其破氣消積、化痰散痞，陳皮以其理氣健脾、燥濕化痰之功入伍溫膽湯方中。柚皮素(Naringenin)屬于二氫黃酮類化合物，是傳統(tǒng)中藥枳實(shí)、陳皮中的重要有效成分[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)柚皮素具有較好的抗氧化、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，容易穿透血腦屏障，在減輕腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要的作用。但柚皮素減輕腦缺血損傷的作用機(jī)制是否與調(diào)控線粒體自噬有關(guān)，目前尚不明確。因此，本研究擬通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索柚皮素調(diào)控線粒體自噬途徑對(duì)小鼠腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生6～7周的SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，體重19.4～21.4 g，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0004。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合3R原則，倫理編號(hào)：DW20210411-075。飼養(yǎng)條件：同周齡小鼠10只/籠，溫度22～25 ℃，濕度70%～75%，自由飲水、進(jìn)食，光照周期12 h∶12 h。

1.2 主要試劑 柚皮素(N164488)，Mdivi-1抑制劑(HY-15886)，強(qiáng)效裂解液(00020210315)，BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，上海緣葉生物科技有限公司)，Tomm20、Timm23、LC3I/Ⅱ、 Cyt C、Caspase3等一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，P62、BNIP3一抗(ABclonal)；GAPDH、山羊抗兔血清二抗(美國，Abcam)，二甲基亞砜 (DMSO，000020210315)。

1.3 儀 器 1659001型蛋白電泳儀、Trans-Blot SD 型半干轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)，低溫冷凍離心機(jī)(珠海黑馬)，微量分光光度計(jì)(北京凱奧)，透射電子顯微鏡(Hitachi)，搖臂顯微鏡、解剖顯微鏡由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，Bio-Rad 化學(xué)發(fā)光成像儀由廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心公共平臺(tái)提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.4.1.1 實(shí)驗(yàn)分組：小鼠190只，分為空白組10只，假手術(shù)組30只，模型組30只，溶劑組30只，柚皮素組30只，Mdivi-1 抑制劑組30只，抑制劑+柚皮素給藥組30只。除空白組外，其余各組均以1、3、7 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)。

1.4.1.2 藥物制備及給藥方式:依次向柚皮素藥品粉末中加入10% DMSO,40% PEG300,5%Tween-80+0.9%氯化鈉溶液,制備澄清的柚皮素(30 mg/kg，0.2 ml/10 g)、抑制劑(50 mg/kg，0.2 ml/10 g)以及柚皮素聯(lián)合抑制劑溶液，每次給藥前配制。每天早10時(shí)，每組動(dòng)物以10%葡萄糖水0.2 ml/10 g灌胃，空白組除外。下午4 時(shí)每組腹腔注射給藥，空白組除外，假手術(shù)組及模型組予0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，溶劑組予不含藥的溶劑腹腔注射。

1.4.1.3 小鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立：參照文獻(xiàn)方法，采用經(jīng)典的大腦中動(dòng)脈栓塞法(MCAO) 制備小鼠腦缺血再灌注損傷模型[7-8]。每只大鼠均缺血2 h，再灌注24 h后用于實(shí)驗(yàn)。雄性C57小鼠，七氟烷持續(xù)吸入麻醉，去除顱骨表面組織，接入激光多普勒血流檢測(cè)儀，置于顯微鏡下，切開小鼠頸部正中，暴露右頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)，游離CCA至分叉處，結(jié)扎后剪斷ECA分支。在距離ECA根部5 mm左右結(jié)扎并剪斷ECA。在ECA遠(yuǎn)端剪開一個(gè)小缺口，邊松開動(dòng)脈夾，邊將線栓(直徑約0.3 mm)送入ICA，阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈(RMCA) 起始處血流，多普勒檢測(cè)RMCA血流下降至20%則提示RMCA栓塞成功?？p合后把小鼠放在保溫箱中。栓塞2 h時(shí)取出線栓。假手術(shù)組采用相同的操作方法，不插入線栓。

1.4.1.4 小鼠神經(jīng)功能缺損測(cè)定：再灌注24 h后，采用Bederson評(píng)分對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)定，總分為5分。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：小鼠不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：小鼠側(cè)推抵抗力下降，并伴向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈行為；3分：小鼠向?qū)?cè)傾倒；4分：小鼠不能自行行走，意識(shí)喪失。評(píng)分越高則小鼠神經(jīng)功損傷越嚴(yán)重。

1.4.1.5 小鼠腦梗死體積測(cè)定：采用TTC法測(cè)定腦梗死體積。分別取各組小鼠，腹腔麻醉后斷頭取腦，用0.9%氯化鈉溶液沖洗，置于-20 ℃冰箱中速凍20 min，取出后，行冠狀大腦切片，2 mm/片，將切片置于1%TTC中，避光，37 ℃溫孵20 min，每隔7～8 min 翻動(dòng)1次，染色后以4%多聚甲醛固定。拍照后用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析處理，采用積分法計(jì)算梗死體積占全腦體積的百分比。

1.4.1.6 電鏡觀察小鼠線粒體結(jié)構(gòu)和線粒體自噬體分布：各組小鼠于造模后1、3、7 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取標(biāo)本，將腦組織浸泡在電鏡固定液中。取1 mm3小塊組織，快速放入電鏡固定液中，在4 ℃下固定2 h。0.1 mol/L PBS(PH 7.4)洗3次，每次15 min。然后用1%的鋨酸0.1 mol/L PBS(pH 7.4)室溫下固定2 h。腦組織依次置于梯度乙醇，100%丙酮中脫水，15 min/次。包埋后，將樣品插入包埋板后37 ℃烤箱過夜。60 ℃烤箱聚合48 h，使用超薄切片機(jī)切制 60～80 nm 超薄切片。鈾鉛雙染色，切片置于室溫中干燥過夜，電子顯微鏡進(jìn)行觀察，采集圖像進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.2.1 皮層神經(jīng)元培養(yǎng)：參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行小鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)[9]。

1.4.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：正常組為小鼠皮層神經(jīng)元正常培養(yǎng)；模型組：正常培養(yǎng)神經(jīng)元糖氧剝奪/再灌注后繼續(xù)培養(yǎng)48 h；模型+柚皮素組：正常培養(yǎng)神經(jīng)元糖氧剝奪/再灌注后用含80 μmol/L柚皮素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h；正常+柚皮素組：正常培養(yǎng)神經(jīng)元加用含80 μmol/L 柚皮素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h;模型+抑制劑組：正常培養(yǎng)神經(jīng)元糖氧剝奪/再灌注后立即用含Mdivi-1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h；柚皮素+抑制劑組：正常培養(yǎng)神經(jīng)元糖氧剝奪/再灌注后立即加入Mdivi-1，用含80 μmol/L柚皮素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4.2.3 小鼠皮層神經(jīng)元糖氧剝奪/再灌注模型(OGD/R)的建立：參照神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注模型制作方法[9],取培養(yǎng)7 d的神經(jīng)細(xì)胞,吸去原培養(yǎng)液,用無糖Earle’s液清洗兩遍后加入無糖Earle’s液維持。將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于可通氣的低氧細(xì)胞培養(yǎng)罐內(nèi),向罐內(nèi)緩慢通入含有95% N2和5% CO2的混合氣體以排除罐內(nèi)原有的空氣,從而降低氧氣濃度。正壓填充30 min后形成低氧環(huán)境,關(guān)閉氣罐,拔掉罐蓋氣體進(jìn)出連接管,置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)(氧糖剝奪,體外模擬缺血缺氧)。90 min后取出缺氧罐,吸去無糖Earle’s液,換回細(xì)胞維持培養(yǎng)液,放入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)正常培養(yǎng)(復(fù)糖復(fù)氧,體外模擬再灌注)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：無菌環(huán)境下，取出各組細(xì)胞培養(yǎng)板，吸棄各孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS 洗滌各孔3次，各孔內(nèi)依次加入已配制好的10% MTT溶液，水平晃勻后，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育約 4 h。輕緩吸棄各孔內(nèi)細(xì)胞溶液，并向各孔內(nèi)加入150 μl DMSO，再繼續(xù)進(jìn)行孵育，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan已全部溶解而未見晶體樣物質(zhì)存在。最后，于酶標(biāo)儀570 nm波長處測(cè)定各孔吸光度值并記錄數(shù)值。

1.4.2.5 電鏡觀察各組細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和線粒體自噬體、線粒體自噬溶酶體分布:參照文獻(xiàn)方法制作小鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞切片，鈾鉛雙染色，切片置于室溫干燥過夜，透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4.2.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)與線粒體內(nèi)TOMM20及COX4I1、P62、自噬標(biāo)記物L(fēng)C3水平和Cyt C水平:Western blot參照文獻(xiàn)的研究方法[8]。使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA進(jìn)行蛋白定量，用15%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至VADF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(兔抗鼠多克隆抗體，1∶1000)，4 ℃過夜。TBST清洗3次，加入二抗(羊抗鼠單克隆抗體，1∶3000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌后，用化學(xué)發(fā)光顯色法顯影，定影，洗片。用Image J圖像處理軟件分析條帶的灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間比較采用單因素方差分析；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 柚皮素對(duì)小鼠腦缺血后神經(jīng)功能缺損的影響：見表1。假手術(shù)組和空白組均為0分。各時(shí)點(diǎn)模型組與溶劑組之間神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。1 d時(shí)，柚皮素組評(píng)分低于模型組、溶劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3 d時(shí)，柚皮素組評(píng)分與模型組、溶劑組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)組意義(P<0.05)。7 d時(shí)，柚皮素組評(píng)分為0，與模型、溶劑組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.1.2 柚皮素對(duì)小鼠腦缺血后腦梗死體積的影響：見表2(圖1)。假手術(shù)組與模型組、溶劑組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各時(shí)間點(diǎn)，模型組與溶劑組之間腦梗死體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，柚皮素組腦梗死體積明顯低于模型組、溶劑組，柚皮素組與模型組、溶劑組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組小鼠腦梗死體積比率比較(%)

圖1 TTC染色法檢測(cè)各組小鼠腦梗死情況

2.1.3 柚皮素對(duì)小鼠線粒體結(jié)構(gòu)和線粒體自噬體分布的影響：空白無圖組、假手術(shù)組線粒體結(jié)構(gòu)正常，未見線粒體自噬體形成。模型組、溶劑組均可見部分線粒體輕度腫脹，膜密度增加，少量線粒體自噬現(xiàn)象。柚皮素組細(xì)胞漿可見大量自噬體形成，部分線粒體腫脹、空泡變性，線粒體膜膜密度增加，大量線粒體自噬，其自噬程度1 d<3 d<7 d。Mdivi-1抑制劑組可見部分線粒體輕度腫脹，膜密度增加，細(xì)胞胞漿偶見少量線粒體自噬，少量自噬體形成。柚皮素+抑制劑組可見少量線粒體自噬現(xiàn)象，少量線粒體部分輕度腫脹，部分線粒體嵴排列紊亂，細(xì)胞胞漿偶見自噬體形成。隨著給藥時(shí)間的增加，線粒體自噬率隨之增加(圖2)。

圖2 各組電鏡線粒體微觀結(jié)構(gòu)(×5000)

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 小鼠原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)結(jié)果：小鼠原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)結(jié)果顯示，神經(jīng)細(xì)胞胞體飽滿,突起相互交織成網(wǎng)絡(luò),細(xì)胞狀態(tài)良好(圖3)。

A:貼壁培養(yǎng)1 d的皮層神經(jīng)元(×100)；B、C:貼壁培養(yǎng)7 d的皮層神經(jīng)元(×200)；D:貼壁培養(yǎng)皮層神經(jīng)元及經(jīng)NSE熒光染色(×100)

2.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：見表3。MTT法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞活力，在0、1 d時(shí)，各組之間細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3、7 d時(shí)，各組間細(xì)胞活力皆與0 d時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3 d時(shí)，其余各組與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；除正常組外，其余各組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。至7 d時(shí)，各組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；除正常組外，其余各組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組間MTT法細(xì)胞活力比較(%)

2.2.3 電鏡觀察小鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和線粒體自噬體分布：空白組線粒體結(jié)構(gòu)正常，偶可見極少數(shù)線粒體自噬體形成，正常+柚皮素組結(jié)果同空白組一致。模型組可見部分線粒體輕度腫脹，膜密度增加，少量線粒體自噬現(xiàn)象。柚皮素組可見胞漿內(nèi)大量髓樣小體、自噬體形成，線粒體膜欠完整，膜密度增加。模型+抑制劑組可見少部分線粒體輕度腫脹，膜密度增加，細(xì)胞胞漿僅偶見少量線粒體自噬體形成。柚皮素+抑制劑組可見少量線粒體部分輕度腫脹，少數(shù)線粒體膜密度輕度增加，細(xì)胞胞漿偶見髓樣小體、自噬體形成(圖4)。

圖4 電鏡觀察小鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體微觀結(jié)構(gòu)(×5000)

2.2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)與線粒體內(nèi)TOMM20及COX4I1、P62、自噬標(biāo)記物L(fēng)C3水平和Cyt C水平：見圖5。正常+柚皮素組自噬相關(guān)蛋白P62、LC3、COX4I1、TOMM20表達(dá)水平高于柚皮素組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組與模型+抑制劑組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平均低于柚皮素組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型+柚皮素組自噬相關(guān)的蛋白表達(dá)水平均高于模型組與模型+抑制劑組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。柚皮素+抑制劑組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平較模型+抑制劑組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型+抑制劑組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞損傷標(biāo)準(zhǔn)蛋白Cyt C表達(dá)水平明顯高于其他組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

缺血性腦卒中屬于臨床神經(jīng)內(nèi)科常見疾病，是指腦血栓形成或在腦血栓的基礎(chǔ)上導(dǎo)致腦梗死而引起的神經(jīng)功能缺損，如偏癱和意識(shí)障礙等一系列相關(guān)病癥[10]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病病理基礎(chǔ)多為動(dòng)脈粥樣硬化，腦組織血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致局部腦組織缺血缺氧和壞死[11]。如何盡快恢復(fù)腦組織血供，防止缺血再灌注損傷，挽救神經(jīng)元，恢復(fù)其功能是治療的關(guān)鍵。從中醫(yī)理論出發(fā)，缺血性腦卒中相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)的“中風(fēng)”等疾病，屬于難治性疾病的范疇，其病機(jī)為年老體衰，或久病氣血虧虛，元?dú)夂膫X脈失養(yǎng)，氣虛不能運(yùn)血，血液運(yùn)行不暢，經(jīng)脈失養(yǎng)，腦脈不充，導(dǎo)致氣滯、血瘀或津阻痰凝，痰瘀互結(jié)阻脈，腦脈失養(yǎng)，虛實(shí)夾雜，正虛邪戀，導(dǎo)致疾病纏綿難愈[12]?！峨y經(jīng)·八難》說：“氣者，人之根本也”，氣虛則氣化功能障礙，脾胃不能化生水谷精氣，水谷精氣不能轉(zhuǎn)化為營氣和津液，則血無以化生，從而導(dǎo)致血脈空虛。《素問·玉機(jī)真藏論篇第十九》也指出:“氣虛身中卒至，五臟絕閉，脈道不通”。王清任根據(jù)自己的實(shí)踐認(rèn)為“無論外感、內(nèi)傷……所傷者無非氣血”，元?dú)馓摬荒苓_(dá)于血管，血液無氣推動(dòng)，必停而留瘀，指出半身不遂主因在于元?dú)馓摀p。治療當(dāng)標(biāo)本兼治，急性期以祛邪為主，虛實(shí)夾雜者宜攻補(bǔ)兼施。

研究表明柚皮素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降脂、降血糖等藥理作用[6]。最近有研究發(fā)現(xiàn)柚皮素干預(yù)對(duì)永久性腦缺血大鼠模型動(dòng)物具有神經(jīng)保護(hù)作用[13],攝入含有柚皮素作為活性成分的枳實(shí)、陳皮可能有助于預(yù)防缺血性卒中[14]。我們團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn)柚皮素通過增強(qiáng)腦缺血小鼠腦內(nèi)NRF2基因的表達(dá)，阻止線粒體去極化，促進(jìn)線粒體自噬，從而減輕小鼠腦缺血再灌注損傷[15-16]。

本研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注損傷1、3、7 d后，柚皮素組小鼠與模型組和溶劑組相比，神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，神經(jīng)功能缺損程度減輕，腦梗死體積縮小。3、7 d時(shí)柚皮素+模型組神經(jīng)元細(xì)胞活力較模型組明顯增強(qiáng)。以上結(jié)果表明柚皮素可以有效減輕小鼠腦缺血再灌注損傷，具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用。

最新研究表明，線粒體功能失調(diào)是加重造成腦缺血再灌注不可逆損傷的主要因素之一。線粒體是進(jìn)行能量代謝、維持氧化還原平衡的重要細(xì)胞器，是腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵靶區(qū)，也是決定神經(jīng)細(xì)胞能否存活的關(guān)鍵因素[17-19]。腦缺血可以誘導(dǎo)缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬,過程中進(jìn)一步激活線粒體自噬可產(chǎn)生顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[20]。本研究通過透射電鏡觀察腦缺血小鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化和線粒體自噬體分布情況，結(jié)果表明腦缺血會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞線粒體腫脹，線粒體自噬增加。柚皮素組可引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)大量線粒體自噬，線粒體自噬程度隨時(shí)間增加而增強(qiáng)，線粒體抑制劑可抑制線粒體自噬。柚皮素組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白P62、LC3、COX4I1、TOMM20表達(dá)水平高于正常組，模型組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平高于模型+抑制劑組，柚皮素+Mdi組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平較模型+抑制劑組升高，說明柚皮素可促進(jìn)線粒體自噬，柚皮素對(duì)腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過激活線粒體自噬實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究通過動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，柚皮素可以有效減輕小鼠腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過激活并增加線粒體自噬，線粒體自噬具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究的結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步開發(fā)有效的神經(jīng)保護(hù)制劑提供了客觀依據(jù)。