有機(jī)物料與土壤質(zhì)地對土壤球囊霉素的影響

溫云杰，刁風(fēng)偉，高 敏，王秀紅，史向遠(yuǎn)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西有機(jī)旱作農(nóng)業(yè)研究院/省部共建有機(jī)旱作農(nóng)業(yè)國家重點實驗室（籌）/有機(jī)旱作農(nóng)業(yè)山西省重點實驗室，山西 太原 030031）

土壤球囊霉素（glomalin-related soil protein）是 由叢枝菌根（AM）真菌分泌的一種耐熱糖蛋白類物質(zhì)，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在，是土壤中重要的有機(jī)碳庫，并且具有促進(jìn)土壤顆粒團(tuán)聚、增加土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性、改善土壤結(jié)構(gòu)的作用[1]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，球囊霉素可以與重金屬元素結(jié)合，降低重金屬元素的活性。可見，球囊霉素對緩解土壤退化、維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用[2]。

球囊霉素的含量與叢枝菌根真菌宿主的植物類型以及根際環(huán)境密切相關(guān)，并且受耕作制度、施肥方式等因素的影響[3]。不同的耕作制度會改變土壤環(huán)境，進(jìn)而影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和活性，最終影響土壤中球囊霉素的含量。與傳統(tǒng)性耕作相比，免耕和少耕的耕作制度能夠顯著提高土壤球囊霉素的含量，這主要是因為長期耕作會破壞叢枝菌根真菌侵入植物根系的能力。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[4]，隨著免耕年限的增加，球囊霉素含量的增加幅度逐漸減小，且球囊霉素含量隨著土壤深度的增加而下降，可能是因為長期免耕會降低土壤中CO2含量，抑制叢枝菌根真菌的生長，最終降低球囊霉素的含量。杜介方等[5]研究發(fā)現(xiàn)，與不施肥、單施化肥的施肥方式相比，有機(jī)-無機(jī)肥配合施用可顯著提高球囊霉素的含量，且提升效果與施用有機(jī)肥的種類密切相關(guān)?？梢?，合理的耕作和施肥方式可以提升土壤肥力、增加微生物豐度和活性，進(jìn)而提高土壤球囊霉素的含量[6]。

土壤質(zhì)地即土壤的機(jī)械組成（黏粒、粉粒、砂粒含量），對土壤的物理性質(zhì)（結(jié)構(gòu)性、熱量、通氣性、水分運移、耕性等）、化學(xué)性質(zhì)（吸附性能、氧化還原性能等）、微生物（生物多樣性、酶活性等）均有重要的影響，并控制著有機(jī)物的降解和土壤有機(jī)質(zhì)的形成[7]，是土壤肥力的物質(zhì)基礎(chǔ)。與砂質(zhì)土壤相比，黏粒較高的土壤可以形成良好的團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)，固定更多的有機(jī)碳，有利于微生物的生長繁殖，并提高有機(jī)物的降解速率。并且有研究認(rèn)為，土壤質(zhì)地對細(xì)菌的影響更為顯著[8]。但是，土壤黏粒過高會造成土壤板結(jié)緊實，有機(jī)質(zhì)減少，阻礙微生物的定殖?？梢?，土壤質(zhì)地可以通過影響有機(jī)質(zhì)的累積、微生物的群落結(jié)構(gòu)和活性等，進(jìn)而影響土壤球囊霉素的含量。準(zhǔn)確地認(rèn)識土壤質(zhì)地對土壤球囊霉素的影響機(jī)制，對于有機(jī)肥的合理施用、土壤肥力的提升等方面具有重要意義。目前，有機(jī)物料與土壤質(zhì)地對球囊霉素的影響缺少更系統(tǒng)的研究。

本研究分別選擇3 種不同質(zhì)地的土壤和有機(jī)物料，通過培養(yǎng)試驗，研究有機(jī)物料的性質(zhì)和土壤機(jī)械組成對球囊霉素含量的影響，以期為退化土壤修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試土壤均采自北京市昌平區(qū)南郝莊村（東經(jīng)116°21′8″、北緯40°21′7″）的撂荒土地，取土深度為10～20 cm，土壤類型為潮土。土壤機(jī)械組成采用激光粒度分析儀（Mastersizer 2000）測定，土壤有機(jī)質(zhì)和全氮含量分別采用重鉻酸鉀容量法和凱氏定氮法測定。其中，黏質(zhì)土壤的理化性質(zhì)為：黏粒含量34.2%，粉粒含量28.4%，砂粒含量37.4%，pH值7.4，有機(jī)碳含量7.37 g/kg，全氮含量1.09 g/kg，稱為高黏粒土壤；黏壤質(zhì)土壤的理化性質(zhì)為：黏粒含量17.2%，粉粒含量43.3%，砂粒含量39.7%，pH值7.6，有機(jī)碳含量8.47 g/kg，全氮含量1.15 g/kg，稱為中黏粒土壤；砂質(zhì)土壤的理化性質(zhì)為：黏粒含量6.2%，粉粒含量8.4%，砂粒含量854%，pH 值8.1，有機(jī)碳含量6.22 g/kg，全氮含量0.92 g/kg，稱為低黏粒土壤。將采集的土壤樣品風(fēng)干，過2 mm篩，備用。

收集當(dāng)?shù)氐呢i糞有機(jī)肥、玉米秸稈和油菜秸稈3 種不同類型的有機(jī)物料。豬糞有機(jī)肥經(jīng)過風(fēng)干，玉米秸稈和油菜秸稈殺青后烘干，上述干燥后的有機(jī)物料粉碎分別過2、0.147 mm 篩，備用。

1.2 試驗設(shè)計

因為上述供試土壤間的微生物活性和群落結(jié)構(gòu)并不一致，可能會對研究土壤質(zhì)地影響有機(jī)物料腐解過程產(chǎn)生干擾，所以，將上述供試土壤先通過高壓滅菌后（121 ℃，209 kPa，30 min），稱取上述滅菌后的土壤200 g，接種相同的土壤菌劑，土壤含水量調(diào)節(jié)至田間持水量的60%，培養(yǎng)7 d 后（25 ℃），使上述供試土壤在培養(yǎng)試驗開始前有較為一致的微生物活性和群落結(jié)構(gòu)。然后，向高黏粒、中黏粒和低黏粒土壤中分別加入10 g 上述豬糞有機(jī)肥、玉米秸稈和油菜秸稈3 種有機(jī)物料，不加有機(jī)物料的土壤為空白對照，共計12 個處理，每個處理設(shè)置5 個重復(fù)。將有機(jī)物料和土壤充分混勻后，采用封口膜密封培養(yǎng)瓶口，25 ℃下避光培養(yǎng)120 d，期間通過稱重法補(bǔ)充水分[9]。

土壤菌劑的提?。喊凑账帘?5∶1 的比例，將去離子水與鮮土（0～20 cm）混合，并加入數(shù)粒玻璃珠，振蕩（200 r/min）2 h 后，離心（1 000 g）10 min，收集沉淀后的土壤顆粒，繼續(xù)加入相同的去離子水，振蕩并離心，上清液即為土壤菌劑[9]。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 供試土壤和有機(jī)物料基本理化性質(zhì)測定 選用過0.147 mm 篩的有機(jī)物料，用碳氮分析儀（Vario MAX CN）分別測定其碳氮含量；利用固體核磁（Bruker AV 300 MHz）測其有機(jī)碳的化學(xué)組成，測試條件為：魔角自旋頻率為10.0 kHz，共振頻率為100.6 MHz，脈沖延遲時間0.5 s，接觸時間為2 ms，采集時間10 ms。將核磁測試圖譜分為5 個化學(xué)位移區(qū)域，每一個區(qū)域代表一種特定的有機(jī)基團(tuán)，0～45 mg/kg 為烷基碳（Alkyl-C）、45～60 mg/kg為含氮烷基碳（N-alkyl C）、60～90 mg/kg 為單烷氧基碳（O-alkyl C）、90～110 mg/kg 為雙氧烷基碳（di-O-alkyl C）、110～160 mg/kg 為 芳 香 族 碳（Aromatic C）、160～190 mg/kg 為 羰 基 碳（Carboxyl C）。采用MestReNova-9.0.1 軟件對上述不同的位移區(qū)域進(jìn)行積分、定量分析。

1.3.2 土壤微生物量碳和氮含量的測定[10]稱取培養(yǎng)后的新鮮土壤樣品12.5 g 于100 mL 離心管中，放入抽氣皿內(nèi)，在抽氣皿底部放入盛有無醇氯仿的小燒杯，抽真空使氯仿沸騰5 min，密封后避光培養(yǎng)24 h（25 ℃），同時，另稱取一批同等質(zhì)量的土壤于100 mL 離心管中，不做熏蒸處理，在相同的條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在通風(fēng)櫥內(nèi)使氯仿散盡，加入50 mL 0.5 mol/L 的K2SO4溶液，振蕩30 min，離心過濾，收集濾液，采用碳氮分析儀（MULTI N/C2100）測定濾液中的有機(jī)碳含量。

1.3.3 土壤球囊霉素含量的測定[11]稱取2.00 g過2 mm 篩培養(yǎng)后的風(fēng)干土壤樣品于50 mL 的離心管中，并加入16 mL 的檸檬酸鈉溶液（濃度為20 mmol/L，pH=7），放入高壓滅菌鍋中（121 ℃，103 kPa）工作30 min，離心（8 000 r/min）并收集上清液，即為易提取態(tài)球囊霉素待測液。同樣，稱取1.00 g 過2 mm 篩培養(yǎng)后的風(fēng)干土壤樣品到50 mL的離心管中，加入16 mL 的檸檬酸鈉溶液（濃度為50 mmol/L，pH=8.0），在121 ℃、103 kPa 條件下工作60 min，重復(fù)提取5 次，離心收集所有上清液，即為總球囊霉素待測液。采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定上述待測液中球囊霉素的含量，吸取上述球囊霉素提取液0.5 mL 于10 mL 的離心管中，并加入5 mL 的考馬斯亮藍(lán)染色劑（G-250），完全顯色后（10 min）在595 nm 波長下比色（UV-2700，島津），測其吸光度，根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算球囊霉素的含量。

1.3.4 土壤磷脂脂肪酸（PLFA）的測定[12]每個處理選擇3 個重復(fù)進(jìn)行土壤磷脂脂肪酸含量的測定，稱取冷凍干燥后的土壤樣品5.0 g，加入25 mL 的提取劑（將甲醇、氯仿、檸檬酸溶液按照2∶1∶0.8 的比例混合），振蕩（25 ℃）2 h 后離心，收集上清液，向離心后殘留的土壤中繼續(xù)加入7.6 mL 的提取劑，振蕩離心，將上清液統(tǒng)一轉(zhuǎn)移至玻璃試管中。然后繼續(xù)向玻璃試管中加入6 mL 的氯仿和4.8 mL 的檸檬酸緩沖液，靜置12 h，分層后將上層氯仿溶液轉(zhuǎn)移至新的玻璃試管中，氮氣吹干。采用氯仿清洗的SPE 柱（Supelco 公司）分離上述提取的磷脂脂肪酸，加入200 μL 9.918 7×10-2nmol/μL 的十九脂肪酸甲脂（C19∶0）作為內(nèi)標(biāo)，繼續(xù)用氮氣吹干。然后進(jìn)行磷脂脂肪酸的甲酯化，向分離后的磷脂脂肪酸中加入1 mL 的甲醇溶液（0.2 mol/L）和1 mL 的甲醇甲苯（體積比1∶1）混合液，水浴加熱（37 ℃、15 min）進(jìn)行甲酯化，繼續(xù)加入0.3 mL 的乙酸和2 mL 去離子水，再用正己烷（C6H14）萃取甲酯化的磷脂脂肪酸，氮氣吹干。采用氣相色譜（N6850，Agilent）對磷脂脂肪酸進(jìn)行定量分析，選用MIDI Sherlock 微生物鑒定系統(tǒng)對其進(jìn)行定性分析[13]，將i14∶0、i15∶0、i16∶0、i17∶0、a15∶0、a17∶0、cy17∶0、cy19∶0w8c、16∶1w5c、16∶1w7c、16∶1w9c、17∶1w8c、18∶1w5c、18∶1w7c 表征為細(xì)菌，18∶2w6 和8∶2w9c 表征為真菌，磷脂脂肪酸的含量單位為nmol/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2016 整理，運用Origin 18.0計算、繪圖，運用SPSS 17.0 進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析、雙因素方差分析和差異顯著性分析（Duncan，P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)物料理化性質(zhì)的分析

3 種有機(jī)物料的碳、氮含量如表1 所示。

表1 3 種有機(jī)物料的碳、氮含量Tab.1 The organic carbon and nitrogen contents of the three organic amendments

3 種有機(jī)物的理化性質(zhì)有較大差異（表1），其中豬糞有機(jī)肥的含氮量最高，為29.3 g/kg，有機(jī)碳含量和C/N 最低，分別為284.2 g/kg 和9.7。而玉米秸稈的含氮量最低，為5.1 g/kg，C/N 最高，為85.8。固體核磁結(jié)果表明（圖1），豬糞有機(jī)肥富含烷基碳、含氮烷基碳，油菜秸稈富含芳香碳，玉米秸稈則含有更多的含氧烷基碳和木質(zhì)素。

圖1 3 種有機(jī)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of three organic amendments

2.2 各處理間微生物量碳和氮含量分析

從圖2 可以看出，與不添加有機(jī)物料的處理（CK）相比，豬糞、玉米秸稈和油菜秸稈可以顯著提高土壤微生物量碳和氮含量（P<0.05）。在中黏粒和高黏粒的土壤中，豬糞處理的土壤微生物量碳含量要顯著高于玉米秸稈處理（P<0.05）。但是，在低黏粒土壤中，3 種有機(jī)物料處理之間的微生物量碳和氮含量并沒有顯著性差異（P>0.05）。土壤質(zhì)地同樣可以顯著影響土壤微生物量碳和氮含量（P<0.000 1）（表2），其中，高黏粒和中黏粒土壤處理中微生物量碳含量要顯著高于低黏粒土壤處理（P<0.05），而中黏粒土壤處理中的微生物量氮含量最高，且顯著高于高黏粒和低黏粒土壤處理（P<0.05）。

圖2 各處理中土壤微生物量碳和氮含量Fig.2 The soil microbial biomass carbon and nitrogen contents in the different treatments

2.3 各處理間土壤球囊霉素含量分析

球囊霉素含量受土壤質(zhì)地和有機(jī)物料類型的共同影響（P<0.01）（表2），與不添加有機(jī)物料的處理（CK）相比，豬糞、玉米秸稈和油菜秸稈可以顯著提高土壤易提取和總球囊霉素的含量（P<0.05），且豬糞處理>油菜秸稈處理>玉米秸稈處理（圖3）。在添加有機(jī)物料后，高黏粒和中黏粒的土壤易提取和總球囊霉素的含量均顯著高于低黏粒土壤（P<0.05）。

表2 雙因素方差分析土壤質(zhì)地和有機(jī)物類型對球囊霉素和微生物量碳、氮含量的影響Tab.2 The influence of the soil texture and organic amendments types on glomalin and microbial biomass carbon and nitrogen analyzed by the two-way ANOVA

圖3 各處理中易提取球囊霉素和總球囊霉素的含量Fig.3 The easily extractable glomalin and total glomalin contents in the different treatments

2.4 土壤質(zhì)地和有機(jī)物料的性質(zhì)對微生物群落的影響

土壤質(zhì)地和有機(jī)物料的性質(zhì)均對微生物含量和群落結(jié)構(gòu)有較大影響（表3、圖4），各處理的細(xì)菌、真菌以及總磷脂脂肪酸含量均為豬糞有機(jī)肥處理>油菜秸稈處理>玉米秸稈處理>CK（P<0.05）。細(xì)菌磷脂脂肪酸的含量隨著土壤黏粒含量的增加呈逐漸升高的趨勢（P<0.05），但是真菌磷脂脂肪酸的含量則呈中黏粒土壤>高黏粒土壤>低黏粒土壤（P<0.05），導(dǎo)致高黏粒土壤中有較高的細(xì)菌/真菌（P<0.05）。并且，高黏粒和中黏粒土壤中的總磷脂脂肪酸含量顯著高于低黏粒土壤（P<0.05）。

圖4 各處理中細(xì)菌、真菌和總磷脂脂肪酸的含量Fig.4 The bacteria，fungi and total PLFA contents in the different treatments

表3 雙因素方差分析土壤質(zhì)地和有機(jī)物類型對細(xì)菌、真菌和總磷脂脂肪酸含量的影響Tab.3 The influence of the soil texture and organic amendments types on the bacteria，fungi and total PLFA contents analyzed by the two-way ANOVA

2.5 土壤質(zhì)地和有機(jī)物料的性質(zhì)對球囊霉素和微生物量碳、氮含量的影響

通過Pearson 相關(guān)性分析土壤質(zhì)地和有機(jī)物料性質(zhì)與球囊霉素和微生物量碳、氮含量間的關(guān)系（表4），微生物量碳含量與土壤黏粒呈顯著正相關(guān)（P<0.05），但是與土壤砂粒呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。對于易提取和總球囊霉素含量，雖然其與土壤的黏粒和粉粒呈正相關(guān)，與土壤的砂粒呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性并不顯著（P>0.05）。有機(jī)物料的性質(zhì)對微生物量碳、易提取和總球囊霉素含量的影響極顯著（P<0.01），其中有機(jī)物料的含氮量和C/N分別與微生物量碳、易提取和總球囊霉素含量呈極顯著的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)（P<0.01）。

表4 土壤質(zhì)地和有機(jī)物性質(zhì)與球囊霉素和微生物量碳和氮含量間的Pearson 相關(guān)性分析Tab.4 The Pearson correlation analysis between glomalin content，microbial biomass carbon and nitrogen and soil texture and organic amendments properties

3 討論

3.1 有機(jī)物料性質(zhì)對土壤球囊霉素含量的影響

添加有機(jī)物料可以顯著提高土壤微生物量碳和氮以及球囊霉素的含量，但是，與玉米秸稈處理相比，豬糞有機(jī)肥和油菜秸稈處理的提升幅度更大。這主要是因為豬糞有機(jī)肥和油菜秸稈的含氮量較高、C/N 更低，且含有更多烷基碳、含氮烷基碳和羰基碳，是多糖、蛋白類物質(zhì)的主要有機(jī)基團(tuán)[14]，在土壤中容易腐解，活性有機(jī)物質(zhì)能夠迅速被微生物所同化，促進(jìn)微生物的生長繁殖，并有利于微生物分泌更多的多糖類物質(zhì)以及真菌菌絲的生長[15]，最終導(dǎo)致球囊霉素在土壤中大量累積。ZHANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與秸稈類有機(jī)物料相比，腐熟的豬糞有機(jī)肥在土壤中可以快速釋放大量的富含羰基碳、含氮烷基碳的可溶性有機(jī)碳，這些活性有機(jī)碳極易被微生物分解、利用，進(jìn)而顯著提高微生物的活性。

對于玉米秸稈處理，其C/N 較高，且富含木質(zhì)素，化學(xué)結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，在土壤中分解速率較為緩慢[17]，微生物在分解這類有機(jī)物時較為困難，缺少足夠的碳源和養(yǎng)分刺激微生物的活性和數(shù)量，所以，玉米秸稈處理的細(xì)菌、真菌含量較低，最終導(dǎo)致微生物量碳和氮以及球囊霉素含量顯著低于其他有機(jī)物處理。但是，相關(guān)研究認(rèn)為，富含芳香碳和木質(zhì)素的低質(zhì)量類有機(jī)物對土壤微生物的刺激以及土壤有機(jī)質(zhì)的提升效果雖然在腐解過程的初期較弱，但是效果較為持久[17-18]，即腐解較長時間后這類有機(jī)物在土壤中的殘留率以及對微生物活性的影響要顯著高于富含活性有機(jī)基團(tuán)的高質(zhì)量有機(jī)物料。而本研究的試驗時間較短，不能觀察到玉米秸稈腐解后期球囊霉素含量的變化，因此，需要在后續(xù)試驗中加長試驗時間，動態(tài)監(jiān)測有機(jī)物料腐解過程中球囊霉素的變化規(guī)律。

3.2 土壤質(zhì)地對球囊霉素含量的影響

本研究表明，土壤質(zhì)地對球囊霉素的影響顯著，并且黏粒含量較高的土壤處理中球囊霉素含量要顯著高于黏粒含量較低的土壤處理。這主要是因為黏粒含量較高的土壤可以形成結(jié)構(gòu)性較為良好的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)[19]，為微生物生長繁殖提供較為穩(wěn)定的環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn)，土壤黏粒含量與細(xì)菌群落的多樣性呈正相關(guān)[20]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，黏粒含量較高的土壤含有更高含量的微生物量碳和氮以及細(xì)菌磷脂脂肪酸含量，并且微生物量碳含量與土壤黏粒含量呈顯著正相關(guān)。這是由于土壤黏粒擁有較大的比表面積，其表面較多的活性位點更有利于微生物的定殖[8]。但是，本研究中球囊霉素含量與土壤黏粒含量并沒有呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，主要是因為高黏粒土壤處理的黏粒含量太高，土壤孔隙較少，透氣性較差，影響了真菌類微生物的生長繁殖[21]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，高黏粒土壤中的真菌含量顯著低于中黏粒土壤處理。PREUSSER 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，真菌更易在孔隙度較大的土壤中生長，真菌菌絲更容易延伸，較大的孔隙為真菌的繁殖提供充足的氧氣。大量研究表明，在質(zhì)地較粗的土壤中真菌的多樣性更為豐富[23]。在大田中，影響微生物的活性以及球囊霉素累積的因素比較復(fù)雜（例如，環(huán)境溫度、降水量、施肥制度等），其中，土壤養(yǎng)分和水分含量、溫度、通氣性等因素最為直接。但是，土壤水分的保持和溫度的調(diào)節(jié)能力很大程度上與土壤孔隙性質(zhì)密切相關(guān)，而土壤的機(jī)械組成直接決定土壤孔隙性質(zhì)。因此，優(yōu)良的土壤質(zhì)地是微生物生長繁殖以及球囊霉素累積的基礎(chǔ)，更有利于土壤肥力的快速提升。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，C/N 較低、富含烷基碳和含氮烷基碳的豬糞有機(jī)肥可快速促進(jìn)微生物的生長繁殖，更有利于球囊霉素在土壤中的累積，并且受到土壤黏粒含量的影響。其中，黏粒含量較高的土壤更有利于微生物定殖，促進(jìn)更多的球囊霉素在土壤中累積，但是，黏粒含量太高不利于真菌的生長?？梢?，有機(jī)肥對土壤的培肥效果與土壤黏粒含量密切相關(guān)。因此，在土壤培肥過程中要充分考慮有機(jī)肥的結(jié)構(gòu)特點和土壤的質(zhì)地類型。