基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接研究消風(fēng)散治療過(guò)敏性結(jié)膜炎的作用機(jī)制※

董照陽(yáng) 陳 茜 魏 偉

(1.江蘇省南京市江寧中醫(yī)院眼科，江蘇 南京 210000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院2019級(jí)博士研究生，江蘇 南京 210000；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院眼科教研室，江蘇 南京 210000)

近年來(lái)，隨著大氣污染的加重及眼部衛(wèi)生因素等影響，過(guò)敏性結(jié)膜炎(allergic conjunctivitis，AC)的發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，患病率高達(dá)30%[1-2]。AC是結(jié)膜對(duì)變應(yīng)原刺激產(chǎn)生超敏反應(yīng)所引起的一類(lèi)常見(jiàn)眼科疾病，主要與免疫球蛋白E(IgE)水平異常所致的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)和部分T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)有關(guān)。AC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未闡明，其主要發(fā)病機(jī)制為變應(yīng)原與眼部組織接觸，并與特異性抗原IgE結(jié)合,導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放前列腺素、組胺、白三烯等因子。AC常見(jiàn)癥狀為眼癢和異物感，并伴有結(jié)膜充血、水腫、濾泡等表現(xiàn)。輕度結(jié)膜炎會(huì)影響人們的生活和工作，重度結(jié)膜炎可造成不可逆轉(zhuǎn)的眼損傷，已引起眼科醫(yī)生的廣泛重視。目前，AC西醫(yī)治療以滴眼藥水為主，主要有抗組胺藥、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、血管收縮劑、非甾體抗炎藥等。但其療程往往較長(zhǎng)，治療后可減輕結(jié)膜組織的變態(tài)反應(yīng)，但用藥一段時(shí)間后病情易反復(fù)，且存在較多副作用[3-4]。

中醫(yī)古籍《諸病源候論·目病諸候》《審視瑤函》和《太平圣惠方》等對(duì)AC均有記載，該病多由風(fēng)熱時(shí)邪侵犯肺衛(wèi)肌表，上壅胞瞼、白睛，阻滯脈絡(luò)，氣血不暢而發(fā)病。故在AC的診治過(guò)程中應(yīng)從整體觀念出發(fā)，全面認(rèn)識(shí)AC的發(fā)病因素。中醫(yī)藥治療AC療效確切且安全性高，為防治AC復(fù)發(fā)和加重積累了豐富診治經(jīng)驗(yàn)。相關(guān)研究表明，中藥可通過(guò)多通路和多靶點(diǎn)發(fā)揮治療AC作用，也可與糖皮質(zhì)激素聯(lián)用，減少糖皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)，在臨床應(yīng)用上具有巨大優(yōu)勢(shì)[5]。中藥治療以清熱利濕、通絡(luò)止痛、解毒涼血類(lèi)為主。消風(fēng)散出自明·陳實(shí)功《外科正宗》，由荊芥、防風(fēng)、牛蒡子、蟬蛻、當(dāng)歸、生地黃、石膏、知母、苦參、蒼術(shù)、胡麻仁、甘草、木通組成，具有疏風(fēng)養(yǎng)血、清熱除濕之功效。該方在臨床上廣泛應(yīng)用于蕁麻疹、濕疹、皮膚瘙癢等皮膚病領(lǐng)域[6-8]。我們?cè)谂R床上依據(jù)養(yǎng)血、疏風(fēng)、清熱和祛濕四法，使用消風(fēng)散治療AC，治療后結(jié)膜充血、眼癢和異物感等諸癥減輕。目前對(duì)消風(fēng)散治療AC的臨床和實(shí)驗(yàn)研究較少，給中藥的有效應(yīng)用帶來(lái)了局限。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)通過(guò)融合系統(tǒng)生物學(xué)和藥理學(xué)揭示了中藥在人體調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)研究中藥、疾病、靶點(diǎn)與通路之間的復(fù)雜關(guān)系，進(jìn)一步闡明中藥作用機(jī)制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)新藥研發(fā)具有重要的意義。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合分子對(duì)接方法，構(gòu)建“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑” 之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)地研究消風(fēng)散治療AC的成分、作用靶點(diǎn)及調(diào)控通路的信息，為以后的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 消風(fēng)散化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)(http：//tcmspw.com)檢索消風(fēng)散的化學(xué)成分，以口服生物利用度(OB)≥30%和類(lèi)藥性(DL) ≥0.18為藥物篩選的關(guān)鍵參數(shù)，記錄最終得到符合條件的化學(xué)成分。并利用此平臺(tái)搜索有效成分的蛋白作用靶點(diǎn)，應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)檢索上述靶點(diǎn)名稱(chēng)，確認(rèn)人源靶點(diǎn)，得到靶標(biāo)蛋白所對(duì)應(yīng)的基因名。

1.2 AC相關(guān)靶點(diǎn)基因獲取 通過(guò)對(duì)人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)(Geen Cards)(https://www.genecards.org)、疾病相關(guān)的基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(Dis Ge NET) v 5.0(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)和療效藥靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)(TTD)4.3.02(https://db.idrblab.org/ttd)，以“allergic conjunctivitis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到AC的相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.3 化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析 將獲得的消風(fēng)散相關(guān)靶點(diǎn)與AC靶點(diǎn)基因進(jìn)行Venn 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)作圖分析，獲得二者交集靶點(diǎn)。然后借助Cytoscape 3.7.2軟件(http://www.cytoscape.org/)進(jìn)行“化合物-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建，根據(jù)化合物與靶點(diǎn)連接情況，篩選消風(fēng)散的主要化合物。

1.4 交集靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶點(diǎn)的PPI進(jìn)行分析，將交集靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇“multiple proteins”模式，物種選擇“Homo sapiens”，最低相互作用評(píng)分設(shè)置為0.9作為篩選條件，從而得到靶點(diǎn)的PPI信息。保存tsv格式文件，導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.2軟件中，獲得PPI，將網(wǎng)絡(luò)結(jié)果可視化，根據(jù)中心度值(BC)、親中心度(CC)和等級(jí)值(DC)篩選關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

1.5 基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析 為了進(jìn)一步了解上述靶標(biāo)蛋白基因的功能以及在信號(hào)通路中的作用，將篩選得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov)，基因列表對(duì)應(yīng)的物種為“Homo Sapiens”，進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。以P<0.05進(jìn)行靶基因篩選，進(jìn)一步說(shuō)明消風(fēng)散的靶點(diǎn)蛋白在基因功能和信號(hào)通路中的作用，并應(yīng)用Graph Pad Prism 7軟件和Omishare(http://www.omicshare.com/tools/index.php)制作柱狀圖和氣泡圖，對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 首先，根據(jù)PPI篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載核心靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)，然后使用Pymol去除水分子和結(jié)合的配體，保存為pdb格式。然后，利用Swiss Dock在線對(duì)接分析對(duì)接服務(wù)器獲得對(duì)接評(píng)分，以評(píng)價(jià)消風(fēng)散關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的對(duì)接效果。

2 結(jié)果

2.1 消風(fēng)散的活性成分及作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果 本研究通過(guò)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)消風(fēng)散方中中藥進(jìn)行活性成分檢索，OB和DL篩選并刪除重復(fù)項(xiàng)后，共得到183個(gè)活性化合物。同時(shí)，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)Related Targets中得到化合物的相關(guān)靶點(diǎn)，由UniProt統(tǒng)一命名后，排除未找到的人的基因，共涉及231個(gè)基因Symbol。

2.2 AC相關(guān)靶點(diǎn)基因的篩選 通過(guò)Geen Cards數(shù)據(jù)庫(kù)得到AC相關(guān)靶點(diǎn)1639個(gè)，通過(guò)篩選設(shè)置relevance score>5，最終獲得363個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)；Dis Ge NET數(shù)據(jù)庫(kù)得到與AC相關(guān)靶點(diǎn)20個(gè)；TTD數(shù)據(jù)庫(kù)得到與AC相關(guān)靶點(diǎn)4個(gè)。刪除重復(fù)靶點(diǎn)16個(gè)，獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)371個(gè)。

2.3 “化合物-疾病靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析 利用Venn 2.1軟件將消風(fēng)散的活性化合物對(duì)應(yīng)的231個(gè)藥物靶點(diǎn)與AC對(duì)應(yīng)的371個(gè)靶點(diǎn)基因取交集，獲得“活性化合物-AC”共同靶點(diǎn)基因49個(gè)，見(jiàn)圖1。將49個(gè)共同靶點(diǎn)通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建消風(fēng)散“化合物-共同靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，提取消風(fēng)散“化合物-疾病靶點(diǎn)”的核心網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。從圖2可看出同一活性成分可作用于不同靶點(diǎn)基因，不同活性成分也可作用于同一靶點(diǎn)基因。其中，連接度較高的化合物有Quercetin、Luteolin、Wogonin、β-sitosterol、Stigmasterol、5-O-Methylvisamminol等(見(jiàn)表1)，這些化合物可能是消風(fēng)散治療AC的關(guān)鍵活性成分。

圖1 消風(fēng)散活性化合物靶點(diǎn)與AC疾病靶點(diǎn)關(guān)系Venn圖

表1 消風(fēng)散治療AC的關(guān)鍵活性成分

紫色橢圓形代表AC相關(guān)靶點(diǎn)基因，綠色長(zhǎng)方形代表有效成分化合物，灰色線條代表相互作用關(guān)系

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建與分析 將49交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING中，保存其tsv格式文件。將獲取tsv文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析后，得到消風(fēng)散對(duì)AC作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中含有45個(gè)節(jié)點(diǎn)，159條相互作用關(guān)系。利用Cytoscape 3.7.2的CytoNCA插件對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析和篩選。如圖3所示，經(jīng)過(guò)2次篩選，BC、CC和DC均大于中位數(shù)的靶點(diǎn)分別為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、JUN、白細(xì)胞介素4(IL-4)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)和絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)。

圖3 消風(fēng)散治療AC相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)及其關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 DAVID中GO功能富集分析以P<0.05為閾值得到79個(gè)條目。其中，生物過(guò)程(BP)條目62個(gè)，細(xì)胞組成(CC)條目7個(gè)，分子功能(MF)條目10個(gè)。取排名前10的條目，通過(guò)Graph Pad Prism 7軟件將這些條目做成可視化條形圖。消風(fēng)散治療AC涉及細(xì)胞因子活性、血紅素結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、過(guò)氧化物酶活性、趨化因子活性和前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶活性等MF；與細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)血壓、T淋巴細(xì)胞增殖的正調(diào)控和凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控等BP相關(guān)；與細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞外基質(zhì)、胞外外泌體等CC相關(guān)。見(jiàn)圖4。

圖4 消風(fēng)散治療AC的GO功能富集分析圖

對(duì)消風(fēng)散作用于AC的主要靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P<0.05為閾值篩選得到55條信號(hào)通路，主要涉及腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、T淋巴細(xì)胞受體(T cell receptor)信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病(IBD)信號(hào)通路等。通過(guò)Omicshare軟件對(duì)其進(jìn)行可視化分析，氣泡圖見(jiàn)圖5。

注：圓點(diǎn)越大，富集基因數(shù)目越多；P值越小，圓點(diǎn)顏色越黑

2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接 選擇關(guān)鍵靶點(diǎn)STAT3、IL-6、JUN、IL-4、VEGFA和MAPK14與對(duì)應(yīng)的核心活性成分Quercetin進(jìn)行分子對(duì)接，以直觀的方式展示Quercetin的最佳構(gòu)型和關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的相互作用。分子對(duì)接結(jié)果如圖6所示，Quercetin與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白有較好的結(jié)合活性，并且分子構(gòu)象結(jié)合穩(wěn)定。如表2所示，蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合越緊密，F(xiàn)ull Fitness值越低。進(jìn)一步證明了消風(fēng)散可能是通過(guò)調(diào)節(jié)以上相關(guān)靶點(diǎn)發(fā)揮治療AC的作用。

表2 Quercetin與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

圖6 Quercetin與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接圖

3 討論

AC是由于變應(yīng)原引起了廣泛的抗原特異性輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)反應(yīng)使眼部結(jié)膜組織發(fā)生的變態(tài)反應(yīng)。Th依據(jù)其生成的細(xì)胞因子分為T(mén)h1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞。Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、干擾素γ(IFN-γ)、TNF-α，Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，抗原特異性Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5等細(xì)胞因子。細(xì)胞因子參與IgE的產(chǎn)生及嗜酸性粒細(xì)胞的激活，促進(jìn)黏液的分泌，從而在AC的發(fā)病中起關(guān)鍵作用[9]。因此，抑制結(jié)膜對(duì)變應(yīng)原反應(yīng)的Th1-Th2反應(yīng)轉(zhuǎn)化是治療AC的關(guān)鍵[10]。Th17細(xì)胞參與一系列炎性反應(yīng)，其主要通過(guò)分泌的細(xì)胞因子IL-17來(lái)發(fā)揮作用[11]。Th17和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞之間的平衡具有體外抗炎作用[12]。

中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床用藥的主要手段，按照中藥配伍規(guī)律，以達(dá)到協(xié)同增效、扶正祛邪的目的。AC屬中醫(yī)學(xué)“目癢”“時(shí)復(fù)癥”“癢若蟲(chóng)行癥”等范疇。《太平圣惠方·治目癢急諸方》曰: “夫目癢急者，是風(fēng)氣客于瞼眥之間，與血?dú)饨蛞合嗖?，使眥癢而淚出?！敝嗅t(yī)學(xué)認(rèn)為，AC因風(fēng)邪侵襲，經(jīng)絡(luò)受阻，或脾胃濕熱內(nèi)蘊(yùn)，外感風(fēng)邪，風(fēng)濕熱相搏，上壅于目所致[13]。常規(guī)治療以祛風(fēng)除濕、健脾清肺或清利濕熱為主。消風(fēng)散中荊芥、防風(fēng)相須為用，以達(dá)腠理、發(fā)汗散邪之效，牛蒡子、蟬蛻疏風(fēng)止癢，共為君藥；蒼術(shù)散風(fēng)除濕，木通、苦參清熱燥濕，石膏、知母清熱瀉火，共為臣藥；佐以當(dāng)歸、生地黃、黑芝麻養(yǎng)血活血；甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏疏風(fēng)養(yǎng)血、清熱除濕之功。

本研究結(jié)果顯示，消風(fēng)散包含23個(gè)有效化合物，其中Degree值較高化合物主要包含黃酮類(lèi)成分、色原酮類(lèi)成分和植物甾醇類(lèi)成分。Quercetin作為存在于荊芥和苦參中的黃酮醇類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)作用[14]。大量研究表明，Quercetin能增強(qiáng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中抗氧化酶的活性[15]，減少炎癥相關(guān)因子IL-6、IL-8等的表達(dá)[16]，抑制視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。相關(guān)研究表明，Quercetin可以調(diào)節(jié)炎性和免疫反應(yīng)來(lái)減輕眼部的炎性反應(yīng)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)穩(wěn)定肥大細(xì)胞、誘導(dǎo)Th1細(xì)胞增加IFN-γ表達(dá)、抑制Th2細(xì)胞分泌IL-4、阻斷IL-6分泌和傳導(dǎo)[17-18]。Wogonin是防風(fēng)和蒼術(shù)中一種重要的黃酮類(lèi)化合物，具有明顯的抗炎和抗氧化作用[19]。張海麗等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Wogonin可能通過(guò)減少巨噬細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，降低核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)調(diào)控炎癥相關(guān)因子(IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α)的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步抑制巨噬細(xì)胞的炎性反應(yīng)。5-O-Methylvisamminol是防風(fēng)中主要的色原酮類(lèi)化合物，具有抗炎、退熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等作用[21]。Sun等[22]研究發(fā)現(xiàn)5-O-Methylvisamminol可通過(guò)NF-κB/IκB-α信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用，改善氧化應(yīng)激，抑制脂多糖(LPS)刺激的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，改善LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁。β-sitosterol是防風(fēng)、荊芥、當(dāng)歸和牛蒡子中主要的植物甾醇類(lèi)化合物，具有抗炎、抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)傷口愈合等廣泛的藥理活性[23]。Zhang F等[24]研究發(fā)現(xiàn)β-sitosterol可以促進(jìn)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和血紅素氧合酶1(HO-1)的表達(dá)，抑制NF-κB、NF-κB受體活化因子配體(RANKL)和STAT3的表達(dá)，發(fā)揮抗關(guān)節(jié)炎作用。Luteolin是荊芥和苦參中的一種天然黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和神經(jīng)保護(hù)等藥理作用[25]。張淑榮等[26]研究表明，Luteolin可通過(guò)抑制Toll樣受體4/髓樣分化因子88(TLR4/MyD88)信號(hào)通路相關(guān)蛋白及其下游炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IL-12)表達(dá)，進(jìn)而有效抑制角膜炎性反應(yīng)，對(duì)煙曲霉菌性角膜炎大鼠具有治療作用。因此，消風(fēng)散中主要活性成分Quercetin、Luteolin、Wogonin、β-sitostero、Stigmasterol和5-O-Methylvisamminol等在治療AC中發(fā)揮重要作用。

多種細(xì)胞因子都參與了AC的發(fā)病機(jī)制，如白細(xì)胞介素、IFN、趨化因子、TNF等[27]。本研究首先基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)初步篩選，消風(fēng)散治療AC作用靶點(diǎn)49個(gè)，并依據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選出6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。PPI結(jié)果顯示抗AC的關(guān)鍵靶點(diǎn)為STAT3、IL-6、JUN、IL-4、VEGFA和MAPK14。結(jié)果顯示，消風(fēng)散可能通過(guò)多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮治療AC的作用。STAT3信號(hào)通路是IL-6發(fā)揮促炎性反應(yīng)和促腫瘤血管新生的主要通路[28]。Guo等[29]研究顯示，通過(guò)增強(qiáng)miR-19b可以抑制AC小鼠模型STAT3的表達(dá)，進(jìn)而減輕眼表的炎性反應(yīng)。IL-6是一種多效細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[30]。AC眼中IL-6表達(dá)升高，促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化和分泌抗體，正向調(diào)節(jié)IgE的生成與活性[31]。在疾病早期，肥大細(xì)胞分泌的IL-4和IL-13可激活結(jié)膜纖維母細(xì)胞，促使其分泌嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、胸腺和激活相關(guān)的趨化因子。c-Jun氨基末端激酶(JNK)在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)和炎性反應(yīng)等方面發(fā)揮重要的作用。MAPK14是MAPK家族中的重要成員之一，其表達(dá)異?？芍旅庖吖δ苁д{(diào)和炎性反應(yīng)?；罨腗APK14激活p38MAPK通路，p38MAPKs在由促炎細(xì)胞因子或外界刺激所引發(fā)的細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[32]。

為了進(jìn)一步說(shuō)明靶蛋白在基因功能和信號(hào)通路中的作用，本研究進(jìn)行了GO功能富集和KEGG通路富集分析。GO功能富集結(jié)果顯示，消風(fēng)散治療AC涉及細(xì)胞因子活性、血紅素結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、過(guò)氧化物酶活性、趨化因子活性和前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶活性等多種物質(zhì)；與細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)血壓、T淋巴細(xì)胞增殖的正調(diào)控和凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控等生物過(guò)程相關(guān)；與細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞外基質(zhì)和胞外外泌體等細(xì)胞組成相關(guān)。由KEGG通路富集分析可知，消風(fēng)散治療AC主要通路有TNF信號(hào)通路、T淋巴細(xì)胞受體信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和IBD通路等?；罨姆蚀蠹?xì)胞可以產(chǎn)生和分泌促炎癥介質(zhì)TNF，在眼表免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，加重了AC癥狀[33]。TNF-α可激活MAPK信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路在各種眼表疾病中起到介導(dǎo)炎癥和調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用[33]。研究表明，T淋巴細(xì)胞所參與的免疫應(yīng)答是機(jī)體整個(gè)免疫調(diào)節(jié)的核心，T淋巴細(xì)胞受體及其他相關(guān)的體液因子在T淋巴細(xì)胞活化與抗原識(shí)別中起重要作用[34]。HIF-1α的表達(dá)影響炎癥發(fā)生及消退，還影響免疫細(xì)胞的募集、遷移、吞噬和殺傷等功能[35]。炎癥部位的多種免疫細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)升高，HIF-1α表達(dá)增高促進(jìn)Th1和Th17的表達(dá)，最終誘導(dǎo)IFN-γ和IL-17的產(chǎn)生[36]?？傊?，消風(fēng)散治療AC與上述通路密切相關(guān)，這表明消風(fēng)散的有效成分可能通過(guò)作用于這些信號(hào)通路以達(dá)到治療AC目的。

分子對(duì)接結(jié)果表明，Quercetin與STAT3、IL-6、JUN、IL-4、VEGFA和MAPK14對(duì)接結(jié)合能分別為-2 924.87、-1 201.35、-3 094.74、-912.55、-2 432.12和-1 818.79 kcal/mol，這提示篩選得到的核心活性成分與靶點(diǎn)之間有較強(qiáng)的結(jié)合活性，同時(shí)也進(jìn)一步證明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)藥物成分與疾病靶點(diǎn)的可靠性，以此發(fā)揮治療AC的作用。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接相結(jié)合的方法，對(duì)消風(fēng)散及AC的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)及PPI分析，初步闡明了消風(fēng)散治療AC的作用機(jī)制?？傊?，消風(fēng)散治療AC的主要活性成分可能為Quercetin、Luteolin、Wogonin、β-sitosterol、Stigmasterol和5-O-Methylvisamminol等，這些活性成分通過(guò)作用于STAT3、IL-6、JUN、IL-4、VEGFA和MAPK14等靶點(diǎn)和TNF信號(hào)通路、T淋巴細(xì)胞受體信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等發(fā)揮對(duì)AC的干預(yù)作用。這也證實(shí)了消風(fēng)散是通過(guò)多靶點(diǎn)、多方面發(fā)揮干預(yù)AC的作用，為后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和機(jī)制的進(jìn)一步探討及臨床應(yīng)用等提供了重要的理論依據(jù)。