泰地羅新注射液對(duì)豬傳染性胸膜肺炎的臨床療效試驗(yàn)

賈 興，張 星，張 沛*，耿智霞，瞿紅穎，宋婷婷，劉 靜，郭李珉，劉 欣，曹興元

(1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，石家莊 050041；2.河北省獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心，石家莊 050041；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083)

豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(APP)引起的一種高度傳染性、致死性呼吸道疾病，以急性出血和慢性的纖維素性壞死性胸膜炎病變?yōu)橹饕卣鳎俏：︷B(yǎng)豬業(yè)的幾大細(xì)菌感染性疾病之一。目前豬傳染性胸膜肺炎的防治仍主要依靠化學(xué)藥物[1-2]。泰地羅新是一種動(dòng)物專用的大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗生素，為泰樂菌素的衍生物，對(duì)一些革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌均具有抗菌活性，對(duì)引起豬、牛呼吸系統(tǒng)疾病的病原菌如胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、副豬嗜血桿菌、溶血性曼海姆菌、睡眠嗜組織菌等尤其敏感[3-5]。本研究對(duì)泰地羅新注射液進(jìn)行了人工感染豬傳染性胸膜肺炎的臨床試驗(yàn)，以明確該藥對(duì)目標(biāo)疾病的臨床療效、確定臨床使用劑量，為該藥在獸醫(yī)臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 受試藥物泰地羅新注射液，河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，規(guī)格50 mL：2 g，批號(hào)TILDI4-1-03；對(duì)照藥物泰地羅新注射液，默沙東動(dòng)物保健品有限公司，規(guī)格100 mL:4 g，批號(hào)A147A01。

菌種，V型(血清型)胸膜肺炎放線桿菌，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)中心保存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)地點(diǎn) 健康杜×長(zhǎng)×大三元雜交豬，2～3月齡，體重20～30 kg，共80頭。未接種過胸膜肺炎放線桿菌疫苗，15 d內(nèi)未接受過全身性抗菌藥物和抗炎藥物(糖皮質(zhì)激素、NSAIDs等)治療。購入試驗(yàn)豬轉(zhuǎn)運(yùn)至四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樓豬舍進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.3 菌種鑒定及染毒菌液制備 菌種鑒定：將冷凍保存的胸膜肺炎放線桿菌(APP)解凍后混勻，醮取少量接種于TSA瓊脂平板，置于5% CO2、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，對(duì)菌落進(jìn)行染色觀察，采用16S rDNA基因 PCR方法進(jìn)行鑒定。

菌液制備：挑取已鑒定確認(rèn)APP的單菌落，接種于TSB 肉湯，置于恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)12～16 h；采用平版計(jì)數(shù)法獲得1 mL原菌液的菌落形成單位(CFU)。用無菌生理鹽水將原菌液稀釋至合適濁度后進(jìn)行染毒復(fù)制疾病。

1.4 人工發(fā)病 將APP菌液稀釋至合適濁度盛于滅菌噴瓶中[6]，以一定的染毒量對(duì)隨機(jī)選擇的8頭試驗(yàn)豬進(jìn)行一次性鼻腔噴霧。染毒后觀察感染豬的臨床表現(xiàn)，記錄各染毒豬出現(xiàn)臨床癥狀的時(shí)間，對(duì)死亡的染毒豬或癥狀典型的染毒豬進(jìn)行剖檢，采集病變組織分離鑒定病原菌。通過8頭試驗(yàn)豬的預(yù)試驗(yàn)，確定將7×108cfu/mL的菌液按0.25 mL/kg體重的染毒量給試驗(yàn)豬一次性鼻腔噴霧，可以復(fù)制出豬傳染性胸膜肺炎疾病模型。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將72頭受試豬隨機(jī)分為6個(gè)組(I、II、III、IV、V、VI組)，每組12頭。按確定的染毒方法對(duì)其中5個(gè)組(I、II、III、IV、V組)的試驗(yàn)豬進(jìn)行染毒復(fù)制豬傳染性胸膜肺炎，1個(gè)組(VI組)不染毒(鼻腔噴霧0.25 mL/kg體重的無菌生理鹽水)作為健康對(duì)照。待染毒豬出現(xiàn)明顯癥狀后(染毒15 h左右)進(jìn)行單次肌內(nèi)注射治療，給藥方案如表1所示。用藥后持續(xù)觀察15 d。試驗(yàn)豬按組隔離飼養(yǎng)于不同圈舍，自由采食和飲水。豬飼料為自配，飼料和飲水不含任何藥物成分。

表1 試驗(yàn)豬給藥方案

1.6 療效評(píng)價(jià)指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn) 分別在染毒前、給藥前、給藥后檢查各豬臨床癥狀表現(xiàn)，分別于染毒前、給藥前、試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)各組試驗(yàn)豬進(jìn)行肺部X光檢查；對(duì)各組試驗(yàn)期間死亡豬、試驗(yàn)結(jié)束時(shí)部分存活豬進(jìn)行剖檢，觀察胸腔臟器病變并按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分；在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，綜合上述各項(xiàng)指標(biāo)觀測(cè)結(jié)果，按標(biāo)準(zhǔn)判定每頭豬的療效(治愈、有效、無效)，計(jì)算各組的治愈率和有效率；稱量計(jì)算試驗(yàn)期間各組豬的增重、耗料和飼料轉(zhuǎn)化率。

治愈：病豬體溫、呼吸、狀態(tài)正常；體重明顯增加；剖檢胸腔臟器無病變；剖檢肺/胸腔積液或鼻拭子無胸膜肺炎放線桿菌檢出。治愈率=(組內(nèi)治愈豬頭數(shù)/組內(nèi)用藥豬頭數(shù))×100%。

有效：病豬體溫、呼吸、狀態(tài)趨于正常；體重不變或有所增加；剖檢胸腔臟器病變較微；剖檢肺/胸腔積液或鼻拭子無胸膜肺炎放線桿菌檢出。有效率=[(組內(nèi)有效豬頭數(shù)+治愈豬頭數(shù))/組內(nèi)用藥豬頭數(shù)]×100%。

無效：用藥后病豬出現(xiàn)死亡；病豬狀態(tài)異常，發(fā)熱明顯，存在嚴(yán)重呼吸癥狀；體重下降；剖檢胸腔臟器病變明顯；剖檢肺/胸腔積液或鼻拭子有胸膜肺炎放線桿菌檢出。

1.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS軟件，各組豬的體溫、狀態(tài)/呼吸/發(fā)熱評(píng)分、胸腔臟器病變?cè)u(píng)分、增重以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示，采用T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；各組病豬的病原菌檢出率、飼料轉(zhuǎn)化率、死亡率、治愈率和有效率以百分比(%)表示，采用卡方(X2)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)和/或組間相同時(shí)間點(diǎn)上述指標(biāo)的差異顯著性。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 臨床檢查結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果顯示，各組(I、II、III、IV、V、VI)試驗(yàn)豬染毒前精神良好、食欲旺盛，呼吸正常。給I、II、III、IV、V組試驗(yàn)豬人工感染胸膜肺炎放線桿菌，12～15 h后染毒豬均出現(xiàn)了不同程度的精神不振，采食量下降，氣喘，咳嗽呼吸困難，體溫升高等臨床癥狀，個(gè)別試驗(yàn)豬還出現(xiàn)了嘔吐現(xiàn)象。按低、中、高劑量給發(fā)病豬單次肌內(nèi)注射河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的泰地羅新注射液，均可有效緩解病豬的上述癥狀。用藥1 d開始起效，用藥4～5 d多數(shù)病豬恢復(fù)正常，之后精神食欲穩(wěn)定，呼吸恢復(fù)正常，癥狀未見反復(fù)。

2.2 試驗(yàn)豬肺部X光檢查結(jié)果 人工感染胸膜肺炎放線桿菌，可引起豬肺部出現(xiàn)炎癥性病變，X光檢查肺野呈現(xiàn)大面積或局灶性的團(tuán)塊狀、云霧狀陰影。按低、中、高劑量給發(fā)病豬單次肌內(nèi)注射河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的泰地羅新注射液，可有效消除病豬肺部的炎癥性病變，其中中、高劑量的效果無明顯差異，與按推薦劑量單次肌內(nèi)注射默沙東動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)的泰地羅新注射液相當(dāng)，均優(yōu)于低劑量。

2.3 試驗(yàn)豬剖檢及胸腔腔器病變?cè)u(píng)分結(jié)果 試驗(yàn)期間死亡豬、試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組存活豬剖檢胸腔腔器病變?cè)u(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。比較各組試驗(yàn)結(jié)束時(shí)剖檢胸腔臟器病變的評(píng)分，藥物對(duì)照組(I組)、各受試藥物組(II、III、IV組)、感染對(duì)照組(V組)、健康對(duì)照組(VI組)之間無顯著差異(P<0.05)。比較整個(gè)試驗(yàn)期間各組尸檢和剖檢胸腔臟器病變的合計(jì)評(píng)分，感染對(duì)照組(V組)顯著高于健康對(duì)照組(VI組)和受試藥物高劑量組(IV組)，其他各組之間無顯著差異(P>0.05)。

表2 試驗(yàn)豬胸腔臟器病變?cè)u(píng)分結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.4 試驗(yàn)豬增重及飼料轉(zhuǎn)化率 各組試驗(yàn)豬的增重和飼料轉(zhuǎn)化率(料重比)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組試驗(yàn)豬的體重均有不同程度增加，其中以健康對(duì)照組(VI組)的體重最高；其后依次為受試藥物高、中劑量組(IV、III組)、藥物對(duì)照組(I組)和受試藥物低劑量組(II組)，增重最低的是感染對(duì)照組(V組)。II組和V組試驗(yàn)豬D15的體重?zé)o顯著差異(P>0.05)，均顯著低于其他組(P<0.05)，而I、III、IV、VI組之間也無顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)期間各組豬的平均增重和日增重，I、III、IV、VI組顯著高于II、V組(P<0.05)，II組顯著高于V組(P<0.05)，其他組間無顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)期間各組試驗(yàn)豬的料重比，健康對(duì)照組(VI組)的料重比最低；其后依次為為受試藥物高、中劑量組(IV、III組)、藥物對(duì)照組(I組)和受試藥物低劑量組(II組)；料重比最高的是感染對(duì)照組(V組)。

表3 試驗(yàn)豬增重、耗料及飼料轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計(jì)(n=12)

2.5 藥物療效評(píng)價(jià) 試驗(yàn)結(jié)束后，綜合各試驗(yàn)豬的死亡情況、臨床表現(xiàn)(狀態(tài)、呼吸、發(fā)熱評(píng)分)、體重變化、胸腔臟器病變?cè)u(píng)分，按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，統(tǒng)計(jì)各組試驗(yàn)豬的治愈率、有效率和無效率，結(jié)果見表4。數(shù)據(jù)顯示，對(duì)照藥物和低、中、高劑量受試藥物對(duì)人工感染豬傳染性胸膜肺炎病豬均有治療效果。其中高劑量受試藥物(Ⅳ組)的有效率和治愈率最高；其次為推薦劑量對(duì)照藥物(I組)和中劑量受試藥物(III組)。分別比較低、中、高劑量受試藥物之間以及各劑量受試藥物與推薦劑量對(duì)照藥物之間的有效率、治愈率和無效率，均無顯著差異(P>0.05)。

表4 試驗(yàn)豬藥物療效評(píng)價(jià)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論與結(jié)論

2011年荷蘭英特威動(dòng)物保健品公司以泰地羅新為主要成分研制的商品名為 Zuprevo無菌注射液通過了歐洲藥物管理局(EMA)獸用藥委員會(huì)的審批，并相繼投放市場(chǎng)。泰地羅新對(duì)牛、豬的呼吸道疾病具有十分明顯的治療效果[7]，藥效強(qiáng)于同類藥物泰樂菌素、替米考星，而且具備動(dòng)物專用、用量少、一次給藥全程治療、超長(zhǎng)的消除半衰期、生物利用度高、低殘留等眾多優(yōu)點(diǎn)[8-9]。

根據(jù)獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則[10]，計(jì)算各組的有效率、治愈率和無效率，作為療效評(píng)價(jià)指標(biāo)，初步評(píng)價(jià)了泰地羅新對(duì)靶動(dòng)物豬適應(yīng)癥的防治作用和安全性，確定合理的給藥劑量方案。以7×108CFU/mL濁度按0.25 mL/kg體重的染毒量給20～30 kg的仔豬一次性鼻腔噴霧胸膜肺炎放線桿菌新鮮培養(yǎng)菌液，可成功復(fù)制豬放線桿菌胸膜肺炎疾病模型。染毒15 h左右，感染豬出現(xiàn)體溫升高，精神沉郁，攝食減少，呼吸困難等典型癥狀；X光檢查感染豬，肺野呈現(xiàn)大面積或局灶性的團(tuán)塊狀、云霧狀陰影；剖檢感染死亡豬，可見出血性、纖維素性胸膜肺炎等典型病變；采集肺部病料，可分離出胸膜肺炎放線桿菌。

按低、中、高劑量給人工感染胸膜肺炎放線桿菌病豬單次肌內(nèi)注射河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的泰地羅新注射液，對(duì)人工感染豬傳染性胸膜肺炎病豬有治療效果?？捎行Ь徑夂拖∝i發(fā)熱、精神食欲不振、呼吸困難等臨床癥狀；有效清除豬體感染的胸膜肺炎放線桿菌；對(duì)抗病原所致機(jī)體的炎癥性損傷，促進(jìn)肺部病變的修復(fù)；降低飼料轉(zhuǎn)化率。用藥1 d開始起效，用藥4～5 d多數(shù)病豬恢復(fù)正常，之后癥狀未見反復(fù)。其中，中、高劑量的效果無明顯差異，中、高劑量的有效率超過90%，治愈率超過80%，與按推薦劑量單次肌肉注射默沙東動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)的泰地羅新注射液相當(dāng)，均優(yōu)于低劑量。

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，傳染性胸膜肺炎病豬使用泰地羅新注射液治療較安全、有效，推薦泰地羅新注射液按一次量每公斤體重4 mg，肌內(nèi)注射治療豬傳染性胸膜肺炎。